壳聚糖及其修饰物的基因纳米粒子的表征及对L02细胞的影响

论文摘要

壳聚糖是由甲壳素脱乙酰基转化而来的一种阳离子多糖,具有良好的生物降解性和生物相容性,可与带负电荷的DNA通过静电作用形成纳米级颗粒,可使DNA免受核酸酶的降解,作为一种具有潜力的基因载体材料,日益引起研究者广泛的关注。壳聚糖作为基因载体的主要缺陷是转基因效率比较低,所以研究者们试图通过修饰以增加壳聚糖的转基因效率。我们实验室的前期工作显示,采用精氨酸和十六烷基修饰壳聚糖,可以明显改善其转基因效率。但修饰后的壳聚糖和DNA形成的纳米粒子对细胞的影响如何,目前还没有相关研究报道。本研究选用壳聚糖基因纳米粒子（Chitosan-DNA nanoparticles,CNP）、精氨酸化壳聚糖基因纳米粒子（Arginine modified chitosan-DNA nanoparticles,ANP）和十六烷基化壳聚糖基因纳米粒子（Hexadecylene modified chitosan-DNA nanoparticles,HNP）,并就其对L02细胞功能的影响进行了初步研究。研究内容主要分为两个部分:1.制备祛除内毒素的质粒DNA,壳聚糖及其上述两种修饰物与DNA按照N/P比4:1的比例采用复凝乳方法制备纳米粒子;采用粒度及zeta电位分析仪进行表征。结果:CNP、ANP和HNP的zeta电位分别为12.1-14.63 mV,粒径约为148.07-179.47nm。2.将上述三种材料与DNA形成的纳米粒子分别以5,10,30,50μg/ml的浓度（以DNA的含量为标准,后同）与L02细胞共孵育24h,采用MTT法进行细胞毒性评价,采用流式细胞分析技术和倒置荧光显微镜检测细胞凋亡,采用荧光分析技术检测活性氧自由基（ROS）的含量,运用Western-blot方法检测细胞色素C（CytC）的释放。结果显示,壳聚糖及其修饰物作为基因运载体系在低浓度下（低于30μg/ml）对L02细胞并未表现出明显毒性反应和引起细胞凋亡,在高浓度下（高于50μg/ml）则显示出一定的毒性作用。经修饰的壳聚糖并未增加壳聚糖的细胞毒性,说明这些修饰可能是安全的。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 基因治疗及纳米技术在医学领域中的应用
• 1.1.1 基因治疗的概念
• 1.1.2 基因治疗的步骤
• 1.1.3 基因治疗的策略
• 1.1.4 基因治疗中有待解决的关键问题
• 1.1.5 理想载体的特征
• 1.1.6 纳米技术在医学领域中的应用
• 1.2 壳聚糖作为基因载体的基因纳米粒子
• 1.2.1 壳聚糖的特性
• 1.2.2 壳聚糖在医用纳米材料方面的应用
• 1.2.2.1 壳聚糖的生理功能及药理作用
• 1.2.2.2 壳聚糖作为纳米材料的应用
• 1.2.3 壳聚糖作为基因载体的不足
• 1.2.4 壳聚糖改性方面的研究
• 1.3 纳米材料的安全性问题
• 1.4 线粒体
• 1.4.1 线粒体的结构与功能
• 1.4.2 线粒体损伤对细胞的影响
• 1.4.2.1 细胞凋亡
• 1.4.2.2 线粒体在细胞凋亡中的作用
• 1.5 论文工作的提出
• 第二章 基因纳米粒子的制备和表征
• 2.1 前言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 原料与仪器
• 2.2.1.1 原料
• 2.2.1.2 仪器
• 2.2.2 质粒的图谱
• 2.2.3 感受态细胞的制备、转化质粒及单克隆菌株的挑选
• 2.2.4 去内毒素质粒 DNA的扩增和提取
• 2.2.5 壳聚糖及其修饰物的基因纳米粒子的制备和表征
• 2.2.5.1 壳聚糖及其修饰物的纳米粒子的制备
• 2.2.5.2 壳聚糖及其修饰物的纳米粒子的表征
• 2.2.6 统计学处理
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 结果
• 2.3.1.1 质粒提取
• 2.3.1.2 纳米粒子的制备及表征
• 2.3.2 讨论
• 第三章 壳聚糖及其修饰物的基因纳米粒子对L02细胞的影响
• 3.1 前言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 原料、仪器与培养液及缓冲液的配制
• 3.2.1.1 原料
• 3.2.1.2 仪器
• 3.2.1.3 培养液及缓冲液的配制
• 3.2.2 L02细胞的培养
• 3.2.2.1 L02细胞的冻存与复苏
• 3.2.2.2 L02细胞在96孔培养板中的培养
• 3.2.3 MTT实验
• 3.2.4 倒置荧光显微镜检测细胞凋亡
• 3.2.5 流式细胞技术检测细胞凋亡
• 3.2.6 活性氧自由基（ROS）的检测
• 3.2.7 细胞色素C（Cyt C）的检测
• 3.2.8 统计学处理
• 3.3 结果和讨论
• 3.3.1 MTT实验
• 3.3.1.1 阳性药物浓度的确定
• 3.3.1.2 不同浓度的基因纳米粒子对L02细胞的毒性
• 3.3.2 倒置荧光显微镜检测细胞凋亡
• 3.3.3 流式细胞技术检测细胞凋亡
• 3.3.4 活性氧自由基（ROS）的检测
• 3.3.5 细胞色素C（Cyt C）的检测
• 全文主要结论
• 参考文献
• 致谢