水稻白叶枯病菌致病性功能基因组学分析

论文题目: 水稻白叶枯病菌致病性功能基因组学分析

论文类型: 博士论文

论文专业: 作物遗传育种

作者: 黄贵修

导师: 黄俊生,何朝族

关键词: 水稻白叶枯病菌,全基因组测序,致病性,突变,基因簇,基因,基因,无毒基因

文献来源: 华南热带农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 革兰氏阴性菌水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)引起的白叶枯病是水稻(Oryza sativa L.)生产上最严重的细菌性病害,它也是研究植物——病原互作的重要模式菌。为研究Xoo致病分子机制,开展致病基因功能基因组学分析,我们用近年来广为使用的“鸟枪法”(shotgun)测序策略对PR6菌株基因组全序列进行测定。构建三套高质量基因组文库,用小片段文库进行大规模序列测定。迄今己完成21211 reads测序工作,测序总长度达16459736 bp,约3.3倍基因组序列覆盖率。序列经初步组装获得529个Contigs,长度达4.94 Mb,得到了PR6菌株基因组全序列基本框架。组装序列分析发现,框架序列中能找到4555个(98.23%)编码蛋白基因序列与Xoo KACC 10331菌株序列高度同源。这为进一步确定和分离Xoo致病基因及其功能基因组学分析奠定了基础。 通过致病性分析,从17184个Tn5转座子插入突变体库中筛选到在水稻感病品种IR24上致病性明显下降或完全丧失的突变体332个。对其中的112个突变体Southern blot分析表明,有105个突变体(93.76%)的转座子在基因组上为单拷贝插入。在PSA培养基上,大多数致病性相关突变体的培养特征与野生型相同,能正常分泌胞外酶。通过TAIL-PCR分离的转座子侧翼片断属于46个基因,还有14个突变体的插入位点位于内源转座子或启动子上或基因间。41个已经确定功能的基因中与分泌系统有关的超过三分之一(15个),说明分泌系统对致病性有重要作用。其它主要是一些与胞外多糖、脂多糖合成有关及与细菌基础代谢和基因调节相关的基因。 有15个突变体的转座子插入位点分别位于Ⅱ型分泌系统xps基因簇的6个基因上,PCR、Southern blot证实突变体确为转座子插入引起。突变体生长培养特征、胞外多糖分泌与野生型无明显差异,但胞外酶不能有效分泌。通过测序和PCR方法得到11037 bp的xps基因簇全长序列,并克隆了其中的6个xps基因;序列同源性分析发现,PR6菌株的xps基因簇与其它病原黄单胞菌小种的序列同源性很高。初步的xps基因簇的SDS-PAGE、RT-PCR和Western blot分析发现,xps基因除共同启动子外,基因内可能还存在一些各自的启动子;突变体中至少有两种蛋白在胞间周质累积,其中有一种蛋白可能编码木聚糖酶。 在112个致病性相关突变体中,发现有一转座子插入到编码芳香族氨基酸代谢途径DAHP合成酶基因(aroG基因)上的突变株。突变株在感病水稻品种IR24上的生

论文目录:

第一章 文献综述

1 植物病原细菌致病性功能基因组学研究进展

1.1 植物病原细菌与水稻白叶枯病

1.2 植物病原细菌致病相关基因

1.2.1 植物病原细菌致病性毒力因子基因

1.2.2 植物病原细菌致病性效应因子基因

1.2.3 植物病原细菌分泌系统及其表面附着结构

2 细菌基因组全序列框架(scalfold)搭建策略概述

2.1 细菌基因组全序列鸟枪法测定

2.2 基于排定顺序的大片段克隆基因组全序列测定

2.3 其它测序方法

2.4 细菌基因组全序列组装及完成

3 植物病原细菌致病机理分子遗传学分析方法

3.1 分离致病基因常用方法

3.2 鉴定致病基因主要实验技术

4 水稻白叶枯病菌致病机理研究进展

5 博士论文选题意义及技术路线

参考文献

第二章 水稻白叶枯病菌PR6菌株基因组全序列初步测定

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

1.2.1 水稻白叶枯病菌基因组DNA制备

1.2.2 pUC18载体制备

1.2.3 小片段(1.6～4.0kb)基因组文库构建

1.2.4 大片段(8.0～10.0kb)基因组文库构建

1.2.5 大规模测序模板制备

1.2.6 大规模序列测定

1.2.7 基因组序列组装

2 结果与分析

2.1 水稻白叶枯病菌基因组DNA制备

2.2 小片段文库构建与质量评价

2.3 大片段文库构建与质量评价

2.4 小片段文库质粒大规模制备及测序

2.5 基因组序列组装

3 讨论

小结

参考文献

第三章 水稻白叶枯病菌致病基因筛选及分子分析

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

1.2.1 突变体库中致病基因突变体筛选

1.2.2 致病性相关突变体基本生化特性测定

1.2.3 水稻白叶枯病菌基因组DNA提取

1.2.4 致病性相关突变体PCR检测

1.2.5 致病性相关突变体中转座子插入拷贝数确定

1.2.6 致病性相关突变体中转座子侧翼片段分离

1.2.7 致病性相关突变体中转座子侧翼序列测定

1.2.8 flgK基因突变体表型分析

2 结果与分析

2.1 水稻白叶枯病菌致病性相关突变体获得

2.2 致病性相关突变体基本生化特征

2.3 致病性相关突变体分子分析

2.4 致病性相关突变体中转座子侧翼序列分析

2.5 flgK基因突变体表型分析

3 讨论

小结

参考文献

第四章 水稻白叶枯病菌Ⅱ型分泌系统xps基因簇遗传分析

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

1.2.1 xps基因簇序列确定与同源性分析

1.2.2 xps基因突变体分子鉴定

1.2.3 xps基因突变体胞外酶活性检测

1.2.4 xps基因突变体细胞不同部分蛋白SDS-PAGE检测

1.2.5 xps基因突变体细胞不同部分蛋白Western blot分析

1.2.6 xps基因突变体RT-PCR分析

2 结果与分析

2.1 xps基因簇序列确定与同源性分析

2.2 xps基因突变体分子分析

2.3 xps基因突变体胞外酶活性分析

2.4 xps基因突变体细胞不同部分蛋白SDS-PAGE分析

2.5 xps基因突变体细胞不同部分蛋白Western blot分析

2.6 xps基因突变体RT-PCR分析

3 讨论

小结

参考文献

第五章 水稻白叶枯病菌aroG基因的克隆与功能初步分析

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

1.2.1 aroG基因突变体在水稻叶片中的繁殖与扩展测定

1.2.2 aroG基因突变体基本生化特性测定

1.2.3 aroG基因的克隆

1.2.4 aroG基因序列分析

1.2.5 aroG基因突变体分子分析

1.2.6 DAHP合成酶活性测定

1.2.7 aroG基因敲除(Knockout)分析

2 结果与分析

2.1 aroG基因突变体在水稻叶片中的繁殖与扩展分析

2.2 aroG基因突变体基本生化特征

2.3 aroG基因序列分析

2.4 aroG基因突变体分子分析

2.5 DAHP合成酶活性测定

2.6 aroG基因敲除(Knockout)分析

3 讨论

小结

参考文献

第六章 水稻白叶枯病菌无毒基因筛选及分子分析

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

1.2.1 PR6菌株突变体库中无毒基因突变体筛选

1.2.2 无毒基因突变体在水稻近等位基因系上的致病反应测定

1.2.3 无毒基因突变体基本生化特性测定

1.2.4 水稻白叶枯病菌基因组DNA提取

1.2.5 无毒基因突变体分子检测

1.2.6 无毒基因突变体中转座子侧翼片段分离与序列测定

1.2.7 PR6菌株基因组文库构建

1.2.8 PR6菌株基因组文库中无毒基因突变体克隆筛选

1.2.9 部分无毒基因突变体基因片段在不同Xoo小种中的同源性检测

2 结果与分析

2.1 水稻白叶枯病菌无毒基因突变体获得

2.2 无毒基因突变体在水稻近等位基因系上的致病反应分析

2.3 无毒基因突变体基本生化特征

2.4 无毒基因突变体分子分析

2.5 无毒基因突变体转座子侧翼序列分析

2.6 PR6菌株基因组文库中无毒基因突变体克隆筛选

2.7 部分无毒基因突变体基因片段在不同Xoo小种中的同源性分析

3 讨论

小结

参考文献

博士期间发表的论文

缩略词表

致谢

发布时间: 2005-07-27

参考文献

• [1].水稻白叶枯病菌无毒新基因的功能鉴定以及Quorum Sensing相关基因的克隆和表达[D]. 梁斌.复旦大学2004
• [2].用基因芯片技术分析水稻白叶枯病菌侵染过程的基因表达图谱[D]. 张新建.中国农业科学院2006
• [3].水稻白叶枯病菌Tdrxoo/GacAxoo调控系统的鉴定及其对运动性和毒性调控功能的分析[D]. 许景升.中国农业科学院2007
• [4].水稻白叶枯病菌遗传多样性分析[D]. 郑伟.华中农业大学2008
• [5].水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae）对链霉素和噻枯唑的抗药性监测和抗药性机制研究[D]. 徐颖.南京农业大学2010
• [6].赖氨酸脱羧酶对水稻白叶枯病菌有机酸毒素的解毒作用及其基因的克隆和表达研究及草酸解毒菌的初步研究[D]. 吴健胜.南京农业大学2000
• [7].水稻白叶枯病菌和条斑病菌对噻枯唑和链霉素的抗药性机理研究[D]. 张勇.南京农业大学2011
• [8].水稻黄单胞菌Ⅲ型分泌系统酚类化合物抑制剂的筛选及其机制研究[D]. 范素素.中国农业科学院2015
• [9].水稻黄单胞杆菌的分子标记与致病相关因子的鉴定[D]. 冯雯杰.山东农业大学2014
• [10].水稻黄单胞菌（Xanthomonas oryzae）hrp基因克隆与特性研究[D]. 陈功友.南京农业大学2000

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• [4].水稻黄单胞菌（Xanthomonas oryzae）hrp基因克隆与特性研究[D]. 陈功友.南京农业大学2000
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• [10].水稻白叶枯病菌Tdrxoo/GacAxoo调控系统的鉴定及其对运动性和毒性调控功能的分析[D]. 许景升.中国农业科学院2007

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