大肠杆菌galU基因在乳酸乳球菌中的克隆及其对胞外多糖产生的影响

论文摘要

乳酸菌的一些菌株可产生胞外多糖（exopolysaccharide，EPS），乳酸菌EPS具有很好的流变学特性，在食品、乳制品加工中具有很大的应用潜力。乳酸菌EPS能增强细菌黏膜吸附，具有抗肿瘤、抗溃疡、促进免疫以及降低胆固醇等生理作用。此外由于乳酸菌是通常认为安全的细菌，具有多种生理活性，不仅产品具有可靠的安全性，而且菌体也可用于食品。但乳酸菌分泌EPS的能力不稳定，许多条件如菌株、培养条件、基质组成，以及EPS生物合成代谢调节均可影响EPS的产量。因此通过培养基与发酵条件优化，超量表达EPS合成的相关酶，在单个质粒上高拷贝克隆eps基因簇，或将含eps操纵子的质粒转入其它微生物进行表达都有可能提高EPS的产量。本文主要进行了产EPS菌种的筛选，大肠杆菌UDP-葡萄糖焦磷酸化酶（UGPase）基因在乳酸乳球菌中的克隆表达，及其对该菌产生胞外多糖的影响等。主要工作如下：1．通过黏度测定初筛，EPS产量复筛，筛选到一株高产EPS的乳酸菌，为实验室保藏的Lactococcus lactis L18，发酵液黏度为349.42 mPa·s，用苯酚-硫酸法测得其EPS产量为716.05 mg／L。在EPS提取过程中，比较了两种除蛋白的方法，8％三氯乙酸除蛋白的方法效果最好。2．采用TA克隆方法构建克隆载体pMD18-T-galU，并通过抗性筛选到阳性克隆子。通过原位PCR，酶切，测序鉴定阳性克隆子含目的基因，构建正确，并进行了同源性检索分析。结果表明，此序列广泛存在于E. coli基因组中，与E. coli O157：H7 str. Sakai DNA仅3个碱基的差异，且均分布于密码子第三位，同源性达到99％，因而编码的蛋白质是相同的，可用于下一步的表达实验。3．成功构建了表达载体pNZ8048-galU，并将其转化到受体菌L. lactis L18中，PCR扩增和限制酶切分析显示构建正确。测序结果表明插入片段大小、序列、位置、方向均正确。采用20 ng／mL nisin进行诱导，SDS-PAGE电泳获得约为33.0 kD大小的表达蛋白带，经FR200型凝胶成像仪扫描，表达蛋白占胞内可溶蛋白18.6％左右。4．对L. lactis L18和构建的L. lactis L18／pNZ8048-galU在EPS产量方面进行了对比。比较了不同的糖，浓度，发酵温度，时间，pH等条件对该菌产生EPS的影响，并比较了相同条件下出发菌株和重组菌产EPS的情况，在含葡萄糖：乳糖（20：20 g／L）的MRS培养基中，L. Lactis L18／pNZ8048-galU在30℃，pH6.5的条件下培养26小时，EPS产量达到最高，为1489.54mg／L；而同条件下L. lactis L18培养28小时达到最高产量，为848.93 mg／L。L. lactis L18／pNZ8048-galU的EPS产量为L. lactis L18的1.75倍。培养时间缩短2小时。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 综述
• 1.1 前言
• 1.2 乳酸菌EPS的功能
• 1.2.1 增强黏膜吸附作用
• 1.2.2 抗肿瘤作用
• 1.2.3 促进机体免疫作用
• 1.3 乳酸菌EPS的应用
• 1.3.1 EPS在食品中的应用
• 1.3.2 EPS其他方面
• 1.4 产EPS乳酸菌及合成途径
• 1.4.1 糖转输入胞质
• 1.4.2 合成糖-1-磷酸
• 1.4.3 糖核苷酸合成及EPS重复单位的聚合
• 1.4.4 EPS的合成及输出
• 1.5 影响乳酸菌EPS合成的因素
• 1.5.1 乳酸菌种类
• 1.5.2 营养基质
• 1.5.3 温度
• 1.5.4 pH值
• 1.5.5 其它影响因素
• 1.6 提高乳酸菌EPS产量的方法
• 1.6.1 传统方法
• 1.6.2 基因工程
• 1.6.3 代谢工程
• 第二章 产胞外多糖乳酸菌的筛选
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 材料
• 2.2.2 主要仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 乳酸菌的活化
• 2.3.2 乳酸菌的分离
• 2.3.3 黏度测定
• 2.3.4 EPS的提取
• 2.3.5 发酵液中蛋白的去除
• 2.3.6 蛋白质含量的测定
• 2.3.7 EPS含量测定
• 2.3.8 菌种保藏
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 乳酸菌的分离
• 2.4.2 黏度测定
• 2.4.3 Folin-酚法测定蛋白质标准曲线
• 2.4.4 多糖除蛋白方法比较结果
• 2.4.5 多糖测定方法的确定
• 2.4.6 EPS的含量测定
• 2.5 小结
• 第三章 大肠杆菌UGPase基因的克隆及序列分析
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 菌株、质粒
• 3.2.2 主要生化试剂
• 3.2.3 引物设计
• 3.2.4 实验仪器
• 3.2.5 常规培养基及溶液的配制
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 菌株培养
• 3.3.2 基因组DNA的提取
• 3.3.3 碱裂解法质粒提取
• 3.3.4 紫外分光光度法测定目的基因与载体的浓度
• 3.3.5 琼脂糖电泳鉴定DNA
• 3.3.6 PCR扩增
• 3.3.7 PCR产物的割胶回收或从溶液中回收纯化
• 3.3.8 目的基因的T/A克隆、筛选和测序
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 E.coli BL21的基因组提取
• 3.4.2 galU基因的PCR
• 3.4.3 克隆重组质粒pMD18-T-galU的构建
• 3.4.4 克隆质粒的鉴定
• 3.4.5 测序及同源性分析
• 3.5 小结
• 第四章 大肠杆菌galU基因在乳酸乳球菌中的克隆表达
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料
• 4.2.1 菌株、质粒
• 4.2.2 主要生化试剂
• 4.2.3 引物
• 4.2.4 实验设备
• 4.2.5 常规培养基及溶液的配制
• 4.3 方法
• 4.3.1 菌株培养
• 4.3.2 高纯度质粒中量提取方法
• 4.3.3 紫外分光光度法测定目的基因与载体的浓度
• 4.3.4 琼脂糖电泳鉴定DNA
• 4.3.5 回收酶切后的大片段
• 4.3.6 限制性酶切
• 4.3.7 目的基因与载体的连接
• 4.3.8 感受态细胞的制作
• 4.3.9 乳酸菌的电穿孔转化和筛选
• 4.3.10 重组载体pNZ8048-galU的鉴定
• 4.3.11 UGPase的诱导表达
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 表达载体的构建
• 4.4.2 表达质粒的鉴定
• 4.5 小结
• 第五章 UGPase基因插入对宿主菌产EPS的影响
• 5.1 引言
• 5.2 实验材料
• 5.2.1 材料
• 5.2.2 主要仪器
• 5.3 实验方法
• 5.3.1 培养方法
• 5.3.2 pH值测定
• 5.3.3 菌体量测定
• 5.3.4 EPS的提取
• 5.3.5 EPS的含量测定
• 5.4 结果与讨论
• 5.4.1 不同碳源对EPS合成的影响
• 5.4.2 培养基初始pH对EPS合成的影响
• 5.4.3 发酵温度对EPS合成的影响
• 5.4.4 培养时间对乳酸菌的生长和EPS合成的影响
• 5.5 小结
• 第六章 结论与建议
• 6.1 结论
• 6.2 建议
• 参考文献
• 简历及发表的论文
• 致谢
• 附录