论文摘要
灵芝（Ganoderma lucidum）在我国已有悠久的应用历史,可用于多种疾病的治疗。三萜类化合物是灵芝的重要药用成分,具有保肝、抗肿瘤、抑制组织胺释放、抑制胆固醇的合成和吸收以及抗HIV和抗HIV蛋白酶的作用等功能。因此,灵芝中三萜含量的高低已经成为灵芝药效高低的重要指标。作为次生代谢产物,三萜类化合物是通过甲羟戊酸途径,由法呢酯焦磷酸产生鲨烯、再转化成2,3-氧化鲨烯,最后经过一系列的氧化、还原和环化反应形成的。法呢基焦磷酸合酶（FPS）处于甲羟戊酸途径中的第一个分支点,是类异戊二烯生物合成过程中的一个关键酶,它可以催化两分子异戊烯基焦磷酸与二甲基烯丙基焦磷酸的相继性头尾缩合,形成法呢基焦磷酸（FPP）。FPS的含量与活性高低会影响三萜化合物产量的多少。根据已发表的其它物种FPS氨基酸序列的保守区,设计简并引物,以灵芝cDNA文库为模板,经PCR扩增,获得了一个456 bp的灵芝法呢基焦磷酸合酶基因特异cDNA片段。利用获得的灵芝法呢基焦磷酸合酶基因特异片段,设计特异性引物,结合cDNA文库的通用引物,扩增得到灵芝FPS基因的5′端cDNA片段。提取灵芝原基时期的RNA,经反转录后的cDNA作为模板,通过3′RACE,获得灵芝FPS基因的3′端cDNA片段。根据扩增获得的序列信息设计引物,以反转录的原基cDNA为模板,得到灵芝FPS基因的全长cDNA序列,该序列全长为1083 bp,编码360个氨基酸残基。其推导的蛋白分子量为42.27kDa。根据灵芝FPS基因全长cDNA序列设计引物,扩增灵芝的基因组DNA,得到灵芝FPS基因的全长基因组序列,该序列全长为1388 bp,FPS基因由4个外显子和3个内含子构成。灵芝FPS蛋白序列比对发现,灵芝FPS与另一种担子菌黄汁乳菇的FPS表现出最高的相似性（59%）,并且包含有不同物种FPS序列中的四个保守区。在FPS的分型中,灵芝FPS属于Ⅰ型（真核状态）法呢基焦磷酸合酶,这与灵芝的物种分类相吻合。将灵芝FPS基因全长cDNA序列克隆到酵母表达载体pYF1845中,转入因缺失FPS活性而依赖麦角甾醇的酵母突变株CC25。结果转化子可以在36℃、不含麦角甾醇的培养基平板上生长,证实了所获得FPS基因cDNA序列的功能。根据灵芝FPS基因DNA序列设计引物,以灵芝基因组DNA为模板,扩增FPS基因上游启动子序列,该序列长约1288 bp,用Softberry软件对启动子序列进行分析,发现灵芝FPS基因启动子中包含有明显的TATA-box和CAAT-box,并发现了多个与固醇、激素和环境压力等调节相关的顺式作用元件。通过竞争性RT-PCR的方法,检测了不同发育阶段灵芝中FPS在mRNA水平的表达差异。结果证明,在灵芝原基中,FPS mRNA的转录水平要明显高于菌丝体中的转录水平。这种差异与Hirotani等所报道三萜含量的变化呈正相关。在培养基中添加植物激素茉莉酸甲酯（methyl jasmonate,MeJA）,对灵芝三萜的生物合成有很好的诱导效果。基于此,对由不同浓度茉莉酸甲酯处理的菌丝体进行了灵芝FPS基因mRNA转录水平的检测。50～200μm茉莉酸甲酯作用下,灵芝FPS基因的转录本表现出持续性增加,150μm的浓度是最佳诱导浓度。同时,在灵芝FPS基因的启动子中发现了两个茉莉酸甲酯响应元件,这样的结果综合表明,灵芝FPS基因可能是经由茉莉酸甲酯响应元件而参与了由茉莉酸甲酯信号调控的灵芝三萜生物合成途径。
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