枯草芽孢杆菌WHNB02中性植酸酶基因在巨大芽孢杆菌中表达研究

论文摘要

本研究从课题组成功克隆的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）WHNB02中性植酸酶基因phyC（GenBank No:AF AY220075）出发,从信号肽切割位点序列之后设计上游引物（引入一个SacⅠ酶切位点）,在终止密码子处设计下游引物（引入一个BamHⅠ酶切位点）,通过PCR去除该酶的信号肽编码序列。PCR扩增得到大小约1.1Kb的单一条带产物,即为目的基因表达片段。该产物经回收纯化后连接到T载体pMD18T上,转化大肠杆菌JM109感受态细胞,经PCR,酶切,测序鉴定后,获得阳性克隆菌株。提取质粒,进行SacⅠ、BamHⅠ双酶切,与经相同双酶切处理的巨大芽孢杆菌表达载体pHIS1525连接,并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选到阳性菌落后提取质粒,并电击转化巨大芽孢杆菌WH320电击感受态细胞,使之在表达载体自身信号肽的引导下进行分泌表达。在含有10μg/mL的Tet抗性平板上筛选后,经菌落PCR鉴定,获得阳性克隆菌株。通过植酸酶酶活测定表明产物具有植酸酶活性。SDS-PAGE分析表明该酶相对分子量约为55KDa。初步优化基因工程菌的培养条件,结果表明:最优条件为接种5%种龄为12h的液体种子,培养4h加入终浓度为0.2%木糖诱导,诱导9h后上清液中酶活可达33U/mL,是出发菌株枯草芽孢杆菌WHNB02的165倍。基因工程菌经液体补料分批发酵9h后,中性植酸酶酶活达到45.3U/mL。中性植酸酶由于研究较少,产酶量较低等原因的尚无商品投入市场。本研究在巨大芽孢杆菌中表达中性植酸酶,并有效的提高了其表达量,具有重要的学术价值和应用前景,为中性植酸酶作为商品投入市场打下了良好的基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1.前言
• 1.1 植酸酶概述
• 1.2 中性植酸酶基因分子生物学研究进展
• 1.3 中性植酸酶的基因工程研究
• 1.4 巨大芽孢杆菌基因工程菌表达外源蛋白的国内外研究进展
• 1.5 表达中性植酸酶工程菌的高密度发酵研究
• 1.6 本研究的前期工作基础
• 1.7 本研究的目的意义及创新点
• 2.技术路线
• 3 材料
• 3.1 菌株及载体
• 3.2 分子生物学试剂
• 3.3 主要药品
• 3.4 抗生素贮存液
• 3.5 常用缓冲液
• 3.6 培养基
• 3.7 主要仪器
• 4.方法
• 4.1 中性植酸酶phyC基因的获得
• 4.1.1 引物设计
• 4.1.2 PCR扩增中性植酸酶phyC基因
• 4.1.3 中性植酸酶phyC基因表达片段的克隆及鉴定
• 4.1.4 中性植酸酶phyC基因表达片段的获得
• 4.2 巨大芽孢杆菌表达质粒的构建
• 4.2.1 pHIS1525表达载体的扩增
• 4.2.2 pHIS1525载体质粒DNA的处理
• 4.2.3 pHIS1525载体质粒与中性植酸酶phyC基因表达片段连接及转化
• 4.2.4 阳性克隆的筛选及鉴定
• 4.3 巨大芽孢杆菌基因工程菌构建和表达研究
• 4.3.1 表达载体pHIS1525-phyC的电击转化
• 4.3.2 重组巨大芽孢杆菌的筛选
• 4.3.3 中性植酸酶phyC基因在巨大芽孢杆菌中的诱导表达
• 4.3.4 植酸酶活性的测定
• 4.3.5 表达产物的SDS-PAGE检测
• 4.3.6 植酸酶基因工程菌培养条件的初步研究
• 4.4 重组巨大芽孢杆菌基因工程菌的补料分批发酵
• 4.4.1 斜面培养
• 4.4.2 种子制备
• 4.4.3 补料分批发酵条件控制
• 5.结果
• 5.1 中性植酸酶phyC基因的获得
• 5.1.1 引物设计
• 5.1.2 PCR扩增中性植酸酶phyC基因
• 5.1.3 中性植酸酶phyC基因表达片段的克隆及鉴定
• 5.1.4 中性植酸酶phyC基因表达片段的获得
• 5.2 巨大芽孢杆菌表达质粒的构建
• 5.2.1 pHIS1525表达载体的扩增
• 5.2.2 pHIS1525载体质粒DNA的处理
• 5.2.3 pHIS1525载体质粒与中性植酸酶phyC基因表达片段连接及转化
• 5.2.4 阳性克隆的筛选及鉴定
• 5.3 巨大芽孢杆菌基因工程菌构建和表达研究
• 5.3.1 表达载体pHIS1525-phyC的电击转化
• 5.3.2 重组巨大芽孢杆菌的筛选
• 5.3.3 phyC基因在巨大芽孢杆菌中的诱导表达及酶活的测定
• 5.3.4 表达产物的SDS-PAGE检测
• 5.3.5 植酸酶基因工程菌培养条件的初步研究
• 5.4 重组巨大芽孢杆菌基因工程菌的补料分批发酵
• 6.讨论
• 6.1 信号肽对外源基因表达的影响
• 6.2 巨大芽孢杆菌基因工程菌构建的关键技术
• 6.3 宿主菌对外源基因表达的影响
• 6.4 培养条件对外源基因表达的影响
• 6.5 补料分批发酵对外源基因表达的影响
• 6.6 进一步研究的建议
• 7.结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的论文