牛奶中抗生素残留检测指示菌的筛选鉴定及检测试剂盒研发

论文摘要

依据微生物抑制法研制的检测牛奶中抗生素残留的试剂盒,因其使用方法简便而被广泛应用。目前试剂盒中的指示菌普遍采用嗜热脂肪芽孢杆菌。本研究以营养需求低、短时间内生长产酸、对常用抗生素敏感为基本原则,从高温环境中分离高温菌。以期分离得到符合试剂盒指示菌要求的菌株,并依据微生物抑制法原理,采用分离的菌株研发试剂盒。主要研究内容及结果如下：1)菌株的分离。从福州市晋安区洗涤厂排热口采集样品,将采集的水样和泥样混合并离心,处理后的混合液涂布于固体培养基中,置于55℃恒温培养箱中培养。依据菌落特征挑取生长较快的单菌落。初步分离纯化得到8株菌。2)菌株的筛选鉴定。依据能够在短时间内使培养液pH值降低、在简单的牛肉膏蛋白胨培养基上生长良好、对常用抗生素敏感三个指标,对8株菌进行复筛,得到一株目标菌株FZ。经过16S rDNA序列分析,结合菌落形态、菌体形态、芽孢形态分析,确定菌株FZ属于厌氧杆菌属（Anoxybacillus）。3)试剂盒制备及参数优化。在单因素试验的基础上对包埋营养物进行优化,得出最佳包埋物为：0.3%葡萄糖、0.2%蛋白胨、0.1%牛肉膏；考察三种指示剂显色情况,确定溴甲酚紫作为最佳显色指示剂；优化包埋芽孢数量及添加牛乳量,得出包埋芽孢量为5×107cfu/mL;添加牛乳量为50μL-80μL。4)试剂盒对几种抗生素的检测限测定。试剂盒对12种抗生素的检测限如下：青霉素、氨苄青霉素：4μg/L；阿莫西林：5μg/L；四环素、土霉素、强力霉素：100μg/L；链霉素、庆大霉素：200μg/L；卡那霉素：1000μg/L；磺胺：100μg/L；磺胺嘧啶：200μg/L；红霉素：40μg/L。5)试剂盒的应用。对有抗奶（有抗生素残留）与无抗奶（无抗生素残留）检测结果的一致性说明试剂盒均一度很好。在检测随机购买的25种牛奶样品时,自制试剂盒检测出两种可疑样品,而商品试剂盒（Delvotest及ECLIPSE50检测试剂盒）则没有检测出可疑样品。其它检测结果与商品试剂盒一致。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 引言
• 1.1 牛奶产业链中抗生素残留现状
• 1.1.1 抗生素残留途径
• 1.1.2 抗生素残留种类
• 1.1.3 抗生素残留危害
• 1.1.4 最大残留量规定
• 1.2 检测方法研究进展
• 1.2.1 微生物检测法
• 1.2.2 酶联免疫法
• 1.2.3 理化检测法
• 1.2.4 免疫传感器法
• 1.3 本课题选题依据、主要研究内容与创新点
• 1.3.1 选题依据
• 1.3.2 主要研究内容
• 1.3.3 创新点
• 第二章 指示菌的筛选
• 2.1 试验仪器、材料与试剂
• 2.1.1 仪器
• 2.1.2 材料
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 样品采集及处理
• 2.2.2 分离菌株产酸及生长情况测定
• 2.2.3 药敏试验
• 2.3 结果
• 2.3.1 采样地环境
• 2.3.2 分离菌株的生长曲线及产酸特性
• 2.3.3 药敏试验结果
• 2.4. 讨论
• 第三章 指示菌株的鉴定
• 3.1 试验仪器、材料与试剂
• 3.1.1 试验仪器
• 3.1.2 试验材料
• 3.1.3 试剂及配制
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 菌体形态特征及生长特性
• 3.2.2 菌体分子鉴定
• 3.2.3 重组质粒的构建
• 3.2.4 序列分析及系统发育树构建
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 FZ菌体形态特征及生长特性
• 3.3.2 分离菌体16S rDNA序列分析
• 3.4讨论
• 第四章 检测抗生素残留试剂盒的制备
• 4.1 试验材料
• 4.1.1 培养基
• 4.1.2 试剂及配制
• 4.2 试验方法
• 4.2.1 产芽孢培养基的筛选及优化
• 4.2.2 芽孢的收集
• 4.2.3 抗生素残留样品的制备
• 4.2.4 试剂盒制备流程
• 4.2.5 试剂盒参数的优化
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 产芽孢培养基的筛选及优化
• 4.3.2 包埋琼脂营养物质正交实验设计
• 4.3.3 包埋营养物质中指示剂的选择
• 4.3.4 芽孢最佳包埋浓度的确定
• 4.3.5 最佳牛乳添加量的确定
• 4.4 讨论
• 第五章 试剂盒的应用
• 5.1 试验材料
• 5.2 试验方法
• 5.2.1 试剂盒检测线确定
• 5.2.2 试剂盒均一度测试
• 5.2.3 试剂盒的应用
• 5.3 结果分析
• 5.3.1 试剂盒检测限确定
• 5.3.2 试剂盒均一度测定
• 5.3.3 试剂盒的应用
• 5.4 讨论
• 结论和展望
• 结论
• 展望
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历