小鼠ES细胞向生殖细胞的诱导分化及体内分化

论文摘要

胚胎干细胞（embryonic stem cells,ESCs）是来源于着床前囊胚内层的细胞团（Inner Cell Mass,ICM）或原始生殖细胞（PGCs）的一种未分化的细胞,具有自我更新、高度增殖和多向分化的潜能。胚胎干细胞在体外和体内具有向三个胚层分化的能力,这一点已经被广泛证明。生殖系细胞的发生是目前生命科学研究的热点课题。生殖细胞与其它体细胞相比具有独特的生物学特性。但在哺乳动物,生殖细胞发生、特化的具体时间和位置及其本质生物学特性仍然是发育生物学界一直研究的热点和难点。近年来,有关胚胎干细胞向生殖细胞分化的研究已有报道,但其诱导效率很低,如何提高其诱导效率尚存在很大困难,其次诱导方法也是备受关注的问题之一。本研究首先以本研究组构建的携带Figlα启动子控制的报告载体（GFP）的小鼠胚胎干细胞（Figlα-ESCs）系为基础,采用卵母细胞提取液以及颗粒细胞共培养的方法诱导胚胎干细胞向雌性生殖细胞分化,尝试为雌性生殖细胞的发生研究建立体外模型。然后以白消安构建的小鼠生殖细胞发生缺损的模型为平台,体内移植Figlα-ES细胞,探讨其在体内的分化潜能。1.以鱼类卵巢卵母细胞为材料制作卵细胞提取液,分别以添加10μg/mL、20μg/mL和50μg/mL三个不同浓度细胞提取液的培养液,诱导小鼠胚胎干细胞向生殖细胞定向分化,通过3 d和7 d的免疫荧光染色及荧光定量PCR检测证明:在无饲养层条件下,添加提取液短期（3 d）培养ES细胞可维持其未分化形态;延长诱导时间到7 d时,添加提取液组的部分细胞变大变圆,表达VASA、SCP3等生殖细胞和卵母细胞特异性标记。2.以鱼类卵巢卵母细胞提取液与小鼠胚胎干细胞进行破膜蛋白融合诱导,7 d时,未观察到较为明显的形态学变化,初步表明其可能没有促进ES细胞向生殖细胞分化的能力。3.将小鼠胚胎干细胞以半透膜包被,移植到生殖缺陷模型小鼠肾被膜下,4 W后采样,通过HE染色及免疫荧光染色证明,移植细胞在受体鼠内可以存活,并在体内微环境诱导下表达VASA、SCP3和Figlα等生殖细胞特异性标记。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 胚胎干细胞定向分化为生殖细胞的研究进展
• 1.1 胚胎干细胞
• 1.1.1 干细胞的定义及分类
• 1.1.2 胚胎干细胞的定义及生物学特性
• 1.1.3 胚胎干细胞的起源及发展
• 1.2 生殖细胞
• 1.2.1 生殖细胞的定义及起源
• 1.2.2 原始生殖细胞的迁移及配子形成
• 1.3 胚胎干细胞的体外定向分化
• 1.3.1 胚胎干细胞体外定向诱导分化方法
• 1.3.2 胚胎干细胞向生殖细胞分化的研究进展
• 1.4 存在的问题及展望
• 试验研究
• 第二章 鱼卵细胞提取液及共培养对 小鼠胚胎干细胞诱导分化的影响
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 试验动物
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 主要仪器及耗材
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 常用溶液配制
• 2.2.2 细胞培养
• 2.3 结果
• 2.3.1 MEF 细胞形态观察
• 2.3.2 m ES 细胞的生物学特征
• 2.3.3 提取液诱导效果
• 2.3.4 共培养诱导
• 2.3.5 提取液融合诱导效果
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第三章 小鼠胚胎干细胞在小鼠体内的发育分化
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 实验动物
• 3.1.2 实验试剂
• 3.1.3 仪器设备及耗材
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 主要溶液配制
• 3.2.2 小鼠生殖缺陷模型制作
• 3.2.3 肾被膜移植
• 3.2.4 采样
• 3.2.5 石蜡切片的制作
• 3.2.6 HE 染色
• 3.2.7 免疫荧光染色
• 3.3 结果
• 3.3.1 小鼠生殖缺陷模型
• 3.3.2 用于移植的带Figlα启动子的ES 细胞形态
• 3.3.3 肾被膜移植
• 3.3.4 细胞移植切片的 HE 染色
• 3.3.5 移植切片的免疫荧光染色
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 结论
• 下一步研究课题
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介