多重耐药鲍曼不动杆菌质粒相关耐药基因的研究以及有效中草药的探索

论文摘要

目的：监测鲍曼不动杆菌的院内感染状况,探讨质粒及质粒上存在的I类整合子与其耐药性之间的关系,进一步阐明该菌的耐药机制,为解释和防治临床上该菌所致的感染提供理论依据,并通过观察20种中草药醇提液对鲍曼不动杆菌的抑菌效果及有效药物对接合传递实验的作用,为临床寻找良好的治疗途径。方法：1.临床分离致病菌的分布及耐药菌的筛选：将2009年3月至9月从南昌大学第一附属医院检验科分离出的致病菌经Microscan-autoscan-φ型自动微生物分析仪鉴定,并测定其对常用抗菌药物（antibacterial agents）的最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentrations,MICs）2.使用Promega试剂盒提取细菌质粒DNA。3.PCR检测鲍曼不动杆菌质粒上耐药基因及I类整合子系统,并测序验证,探讨其与该菌耐药性的关系。4.以对17种10类实验所用抗菌药物全耐药且携带基因型blaTEM-1,blaPER-1, blaOXA-23,blaIMP-1及I类integron的鲍曼不动杆菌（10688号）做供体菌,大肠埃希菌ATCC25922作受体菌,进行耐药基因的结合传递实验,分析接合子的药敏特点、耐药基因型及传代稳定性,探讨耐药质粒在耐药传递中的作用。5.筛选抑制MDR A. baumannii的有效中草药并测定MIC值,观察有效中草药对接合实验的影响。结果：1.2009年3至9月共分离到2948株菌,最常见的G+菌有金黄色葡萄球菌和溶血性葡萄球菌等,最常见的G-菌有鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌等；细菌的分布以痰液中分离的最多（44.1%）,主要来源于呼吸内科（11.13%）和ICU（8.92%）。药敏结果表明：G+菌中,MRSA检出率高达有56.87%,HLAR型屎肠球菌高达86.79%,糖肽类抗生素对常见球菌保持高度敏感性。G-菌中,肠杆菌对阿米卡星,亚胺培南,哌拉西林/他唑巴坦敏感性较高,产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌分别为73.21%、50%,鲍曼不动杆菌对氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、氨曲南、亚胺培南、头孢替坦的耐药率分别为49.77%、53.17%、96.8%、38.22%、99.54%,比其他地区报道的耐药率普遍增高。铜绿假单胞菌对常用抗菌药物耐药率也有升高趋势。共收集71株对多种药物耐药的鲍曼不动杆菌。2.71株多重耐药鲍曼不动杆菌中,OXA-58,OnrA, VIM-2未发现携带,blaTEM-1,blaPER-I,blaOXA-23,blaIMP-I的携带率为69（97.2%）,43（60.6%）,63（88.7%）,46（64.8%）。同时携带这四种基因型的菌株为24株（33.8%）。基因检测率高,并且所有菌株质粒上均可检测GyrA.3.94.4%的菌株检测出Ⅰ类整合子系统。携带Ⅰ类整合子的所有菌株均显示多重耐药。4.供体菌通过接合将其质粒上带的对氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、头孢唑林、头孢曲松、头孢唑肟、头孢吡肟、氨曲南的耐药及blaPER-1、整合子基因传给了受体大肠埃希菌ATCC25922且可稳定传代。5.20种中草药中五倍子、黄连乙醇提取物对多重耐药鲍曼不动杆菌有较强的抑菌活性, MIC分别高达0.195 mg/ml和6.25mg/ml,且可以抑制细菌的接合传递实验。结论：1.本监测HLAR型肠球菌、MRSA产生率高,产ESBLs的肠杆菌、多重耐药的非发酵菌检出率高,细菌的耐药性日趋严重,医院应加强抗生素使用的管理,促进抗生素的合理使用,以降低医院感染率和病死率2.多重耐药鲍曼不动杆菌质粒上发现多种耐药基因并可在质粒上同时携带4种耐药基因,可见质粒在细菌爆发中起着关键的作用.3.PCR法是一种快速检出Ⅰ类整合子系统的方法,操作简便。Ⅰ类整合子系统与鲍曼不动杆菌多重耐药性之间有密切的关系。4.质粒可将耐药基因及药物耐药性传递且稳定传代是鲍曼不动杆菌呈现多重耐药的机制机制之一。5.五倍子乙醇提取物抑菌效果明显,为临床多重耐药鲍曼不动杆菌感染治疗提供参考。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 第一部分 临床分离致病菌的分布
• 材料与方法
• 1.1 试剂
• 1.2 仪器
• 1.3 方法
• 1.3.1 菌株来源与分离鉴定
• 1.3.2 药敏敏感实验方法
• 1.4 统计处理
• 结果
• 2.1 细菌分布
• 2.1.1 菌种分布
• 2.1.2 标本分布
• 2.1.3 科别分布
• 2.2 菌株对各种抗菌药物的耐药状况
• 2.2.1 临床常见G+菌的耐药状况
• 2.2.2 临床常见G-菌的耐药状况
• 2.2.3 非发酵菌的耐药状况
• 讨论
• 第二部分 鲍曼不动杆菌耐药现状分析及多重耐药菌株的筛选
• 材料与方法
• 1.1 试剂
• 1.2 仪器
• 1.3 方法
• 1.4 统计处理
• 结果
• 2.1 标本来源
• 2.2 鲍曼不动杆菌在不同标本中的分布
• 2.3 对抗菌药物的耐药情况
• 2.4 筛选出多重耐药鲍曼不动杆菌
• 结论
• 第三部分 多重耐药鲍曼不动杆菌质粒的耐药相关性研究
• 材料与方法
• 1.1 试剂
• 1.2 仪器
• 1.3 方法
• 1.3.1 质粒DNA抽提
• 1.3.2 PCR实验
• 1.3.3 琼脂糖凝胶的配制
• 1.3.4 5×TBE电泳储存液
• 1.3.5 接合实验
• 1.3.6 PCR产物测序及序列分析
• 结果
• 2.1 71株鲍曼不动杆菌的药敏情况
• 2.2 PCR扩增结果
• 2.3 接合实验
• 2.4 供体菌和接合子的耐药基因分型
• 2.5 供体菌和接合子的菌种鉴定及药敏实验结果
• 2.6 接合子子代耐药性的传代稳定性
• 2.7 测序结果及序列分析
• 2.7.1 TEM-1测序结果及序列分析
• 2.7.2 PER-1测序结果及序列分析
• 2.7.3 OXA-23测序结果及序列分析
• 2.7.4 GyrA测序结果及序列分析
• 2.7.5 Intell测序结果及序列分析
• 2.7.6 Intell高变区测序结果及序列分析
• 结论
• 第四部分 多重耐药鲍曼不动杆菌的抑菌中草药的探索
• 材料与方法
• 1.1 试剂
• 1.1.1 菌株来源
• 1.1.2 中草药
• 1.1.3 培养基
• 1.1.4 其它
• 1.2 仪器
• 1.3 方法
• 1.3.1 中草药的煎制
• 1.3.2 自制药敏纸片
• 1.3.3 KB法药敏试验
• 1.3.4 琼脂稀释法
• 1.3.5 中草药抑制接合实验
• 结果
• 2.1 20种中草药的抑菌效果
• 2.2 有效中草药的MIC值的测定
• 2.3 五倍子对接合传递实验的作用
• 2.3.1 空白组
• 2.3.2 实验组
• 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读学位期间的研究成果
• 综述
• 参考文献