鸭肠炎病毒US2蛋白细胞定位及感染相关功能的研究

论文摘要

鸭病毒性肠炎（duck viral enteritis, DVE）,又名鸭瘟（duck plague, DP）,是鸭、鹅及多种雁形目禽类的一种急性、热性、败血性传染病,曾相继在多个国家和地区流行,给养鸭业造成巨大的经济损失。本病病原为鸭肠炎病毒（Duck enteritis virus, DEV）,属疱疹病毒科未分类病毒,尚未定亚科及属。疱疹病毒us2基因为病毒复制非必需基因,但对病毒的侵入及细胞间传递有一定的抑制作用。US2蛋白参与病毒的免疫逃避机制,与主要组织相容性复合体特异性结合能诱发其降解,从而抑制抗原向T淋巴细胞提呈。针对US2蛋白的功能研究对进一步了解病毒感染机制有重要意义。本研究以鸭肠炎病毒（DEV） C-KCE株基因组DNA为模板,PCR扩增得到us2 ORF,并对其进行了包括氨基酸同源性、编码蛋白结构及抗原性等较为详尽的生物信息学分析。利用大肠杆菌表达系统pET32a（+）（E. coli Rosetta）获得大小为46 KDa的重组蛋白。将纯化的蛋白免疫家兔,制备兔抗重组US2蛋白多克隆抗体,琼脂扩散试验测定血清效价为1：8。经western blot及间接免疫荧光试验分析此抗体针对DEV US2蛋白有良好的反应性。以制备的兔抗US2蛋白血清作为一抗,与病毒接种的CEF进行间接免疫荧光反应,经激光共聚焦显微镜观察,发现特异性荧光染色主要集中于细胞膜和核周围的胞质区。在接种DEV的鸡胚成纤维细胞培养液中添加US2抗体,分别检测US2蛋白在病毒的吸附、侵入、细胞到细胞间的直接传播中的作用,以及对病毒滴度的影响。结果表明,加入US2抗体实验组与对照组相比,病毒侵入率及形成的噬斑大小有明显差异,但是吸附率差异不明显,说明DEV US2蛋白可能参与病毒侵入及细胞间传递的过程。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 1.1 鸭病毒性肠炎概述
• 1.1.1 临床症状与病理剖检
• 1.1.2 诊断
• 1.1.3 鸭病毒性肠炎的防治
• 1.1.4 存在的问题及防治措施
• 1.2 鸭肠炎病毒研究进展
• 1.2.1 鸭肠炎病毒的生物学特性
• 1.2.2 鸭肠炎病毒的复制
• 1.2.3 鸭肠炎病毒的分子生物学特性
• 1.3 疱疹病毒US2蛋白的特性、功能及应用
• 1.3.1 疱疹病毒US2蛋白的特性
• 1.3.2 疱疹病毒US2蛋白的生物学功能
• 1.4 本研究的目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 毒株、菌株、细胞和载体
• 2.1.3 引物
• 2.1.4 试剂
• 2.1.5 主要溶液配制
• 2.1.6 主要试验器材及仪器设备
• 2.2 鸭肠炎病毒的增殖与提纯
• 2.2.1 病毒的增殖
• 2.2.2 病毒的提纯
• 2.2.3 电镜观察
• 2.3 鸭肠炎病毒us2基因的克隆
• 2.3.1 DEV基因组DNA的提取
• 2.3.2 us2基因的扩增
• 2.3.3 PCR产物的克隆与转化
• 2.3.4 重组阳性质粒的筛选与鉴定
• 2.3.5 鸭肠炎病毒us2基因及其编码蛋白的生物信息学分析
• 2.4 鸭肠炎病毒US2蛋白的原核表达与鉴定
• 2.4.1 us2基因表达载体的构建及鉴定
• 2.4.2 目的基因的诱导表达及纯化
• 2.4.3 表达产物的Western blot分析
• 2.5 兔抗US2蛋白高免血清的制备及鉴定
• 2.5.1 多克隆抗体的制备
• 2.5.2 多克隆抗体效价测定
• 2.5.3 兔抗US2血清反应性的鉴定
• 2.6 鸭肠炎病毒US2蛋白细胞定位的研究
• 2.7 鸭肠炎病毒US2蛋白感染相关功能的研究
• 2.7.1 鸭肠炎病毒US2蛋白对病毒吸附的影响
• 2.7.2 鸭肠炎病毒US2蛋白对病毒侵入的影响
• 2.7.3 鸭肠炎病毒US2蛋白对病毒细胞与细胞间传播的影响
• 3 结果
• 3.1 超离粗纯鸭肠炎病毒的电镜结果
• 3.2 鸭肠炎病毒us2基因的克隆
• 3.2.1 鸭肠炎病毒us2基因的扩增
• 3.2.2 重组克隆载体的鉴定
• 3.3 鸭肠炎病毒us2基因及其编码产物的生物信息学分析
• 3.3.1 us2基因及其编码产物的同源性分析
• 3.3.2 US2蛋白的结构预测与功能性基序分析
• 3.3.3 US2蛋白的抗原性分析
• 3.4 鸭肠炎病毒US2蛋白的原核表达与鉴定
• 3.4.1 重组表达载体的构建及鉴定
• 3.4.2 目的基因的诱导表达及纯化
• 3.4.3 表达产物的抗原性分析
• 3.5 兔抗US2蛋白高免血清的制备及鉴定
• 3.5.1 多抗血清效价测定
• 3.5.2 兔抗US2血清反应原性的鉴定
• 3.6 鸭肠炎病毒US2蛋白的定位
• 3.7 鸭肠炎病毒US2蛋白的感染相关功能研究
• 3.7.1 鸭肠炎病毒US2蛋白对病毒吸附的影响
• 3.7.2 鸭肠炎病毒US2蛋白对病毒侵入的影响
• 3.7.3 鸭肠炎病毒US2蛋白对病毒细胞与细胞间传播的影响
• 4 讨论
• 4.1 DEV us2基因编码产物的生物信息学分析
• 4.2 鸭肠炎病毒粒子的初步纯化
• 4.3 DEV us2基因表达、纯化及多抗血清的制备
• 4.4 鸭肠炎病毒US2蛋白定位的研究
• 4.5 鸭肠炎病毒US2蛋白感染相关功能的研究
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文