人/猴免疫缺陷病毒p27蛋白单克隆抗体的制备

论文摘要

人免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus, HIV）与猴免疫缺陷病毒（Simian immunodeficiency virus, SIV）同属于反转录病毒科慢病毒属,两者的亲缘关系很近。SHIV,即SIV/HIV嵌合病毒,是利用基因重组技术将SIV和HIV的相应基因进行置换而构建出来的重组嵌合病毒。目前,SHIV/恒河猴动物模型被广泛应用于AIDS的研究当中。衣壳蛋白p27是SHIV的主要抗原成分之一,也是制备抗p27单克隆抗体必需的免疫原,应用十分广泛。本文旨在利用基因工程的方法获得高纯度的p27抗原,制备抗p27单克隆抗体,用于探索构建检测p27抗原的诊断试剂盒。根据GenBank发表的人/猴免疫缺陷病毒SHIV89.6P全基因组序列设计合成一对引物（含有EcoR I和Xho I两个酶切位点）,利用PCR技术从质粒SHIV89.6P中扩增p27gag基因,并克隆入pMD18-T载体,测序鉴定;将p27gag基因插入表达载体pET32a T7启动子下游,构成重组质粒pET32a-p27并使其在大肠杆菌BL21中高效表达。利用SDS-PAGE电泳观察外源基因表达条带大小是否与预期相符。利用固定化金属离子（Ni2+）配体亲和层析技术从表达蛋白中纯化目的蛋白,Western Blot检测。将纯化后的p27抗原免疫Balb/c小鼠。取免疫鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0,用PEG融合。经HAT、HT选择培养后,通过有限稀释法筛选出能产生p27抗体的杂交瘤细胞株。最后将扩大培养的杂交瘤细胞注入Balb/c小鼠腹腔,每只注射5×106个细胞使其产生腹水,制备单克隆抗体。本试验主要结果如下:1.将PCR产物进行电泳分析,获得与预期结果一致的大小为763bp的p27基因。2.对重组质粒T-p27与pET32a-p27分别进行双酶切和测序鉴定:双酶切结果正确,DNA序列分析结果表明p27基因片段未发生碱基突变或缺失,证明重组质粒已成功构建。3.重组质粒pET32a-p27转化大肠杆菌BL21,将IPTG小量诱导产物进行SDS-PAGE电泳分析,与空白对照pET-32a转化大肠杆菌BL21后经IPTG小量诱导的产物相对照,在分子量43Ku和66.2Ku之间可见一个明显的蛋白条带,与预期结果46Ku的p27抗原大小一致,表明重组质粒可以正确表达目的蛋白。对超声波破碎后离心所得的沉淀和上清进行SDS-PAGE电泳分析,证实目的蛋白多以可溶形式存在。4.经Ni2+亲和层析纯化后,证实目的蛋白的纯度可达90%以上,表明已获得纯度较高的目的蛋白。5.以纯化后的目的蛋白作为抗原进行单克隆单体制备,获得5株单抗,分别命名为1A5、1C7、3C2、2D12、3D12。应用间接免疫荧光技术（IFA）和蛋白免疫印迹技术（Western Blot）进行验证,结果表明所获得的单克隆抗体均具有良好的特异性。本研究成功的制备了5株能稳定分泌抗p27蛋白特异性抗体的杂交瘤细胞株,试验结果表明5株单抗均可进行体外病毒抗原的检测且结果良好,为进一步研制抗原检测试剂盒以及对艾滋病病毒的研究奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 研究的目的和意义
• 1.2 艾滋病及其流行现状
• 1.3 HIV 的研究概况
• 1.3.1 HIV 病毒粒子结构
• 1.3.2 HIV 基因组结构与功能
• 1.3.3 HIV 的生活周期
• 1.4 SHIV 简介
• 1.4.1 SHIV 的由来
• 1.4.2 SHIV 的构建及特性
• 1.4.3 SHIV 在AIDS 疫苗研究中的应用
• 1.5 SHIV 的检测
• 1.5.1 常用SHIV 检测方法
• 1.5.2 SHIV 检测中的重要抗原p27 及其特征
• 1.6 单克隆抗体技术
• 1.6.1 单克隆抗体的特点
• 1.6.2 单克隆抗体技术的应用
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 细胞、菌株与质粒
• 2.1.3 引物合成与测序
• 2.1.4 主要酶类及生化试剂
• 2.1.5 主要试剂的配制
• 2.1.6 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 目的基因的克隆
• 2.2.2 p27 基因的鉴定
• 2.2.3 重组表达载体的构建与鉴定
• 2.2.4 融合蛋白的表达
• 2.2.5 融合蛋白的纯化
• 2.2.6 杂交瘤细胞株的建立
• 2.2.7 杂交瘤细胞株的筛选
• 2.2.8 阳性杂交瘤细胞的克隆
• 2.2.9 杂交瘤细胞株的冻存与复苏
• 2.2.10 单抗腹水的生产
• 2.2.11 杂交瘤细胞及单抗的鉴定
• 3 结果与分析
• 3.1 目的基因的获得
• 3.2 P27 基因的鉴定
• 3.3 重组表达载体的鉴定
• 3.4 融合蛋白的表达
• 3.5 融合蛋白的纯化及定量
• 3.6 免疫小鼠血清效价测定
• 3.7 筛选方法的建立
• 3.8 杂交瘤细胞株的建立
• 3.8.1 杂交瘤细胞株的筛选
• 3.8.2 阳性杂交瘤细胞的克隆
• 3.9 杂交瘤细胞及单抗的鉴定
• 3.9.1 杂交瘤细胞的稳定性试验
• 3.9.2 杂交瘤细胞染色体分析
• 3.9.3 单克隆抗体亚类分析
• 3.9.4 单克隆抗体腹水效价测定
• 3.9.5 单克隆抗体特异性测定
• 4 讨论
• 4.1 融合表达载体的选择
• 4.2 表达条件的常规优化
• 4.3 抗原制备
• 4.4 细胞融合与筛选
• 4.5 杂交瘤细胞的克隆
• 4.6 单克隆抗体特异性的鉴定
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文