小麦低亲和性阳离子转运蛋白基因LCT1的定位、表达及功能研究

论文摘要

土壤盐渍化和次生盐渍化是世界范围内日益严重的问题,可引起多种作物的减产,是制约农业发展的主要瓶颈之一。盐渍化土壤中主要含有较高浓度的氯化钠,其水解电离产生的Na+对作物的生长有强烈的抑制作用。研究Na+相关的转运蛋白对植物抗盐有非常重要的意义。小麦是世界上重要的粮食作物之一,也是我国主要的粮食作物,提高小麦的耐盐性,培育耐盐小麦新品种对保证我国的粮食生产,可持续稳产、高产有着深远的意义。Schachtman等人利用K吸收缺陷型酵母进行功能互补实验,从小麦根cDNA文库中筛选到与Na+吸收有关的离子转运蛋白基因HKT1（high-affinity K+transporter）和LCT1（low-affinity cation transpoter）。目前对HKT1的研究较多,对LCT1的报道较少。LCT1的二级结构显示,其包含9个跨膜区域以及2个富含Pro、Ser、Thr及Glu序列的亲水氨基酸末端PEST序列。LCT1主要在小麦根部和叶片表达。LCT1的异源表达结果表明:可跨膜转运多种阳离子,有一定的非选择性。例如不仅能转运K+,而且还能转运Na+、Rb+、Cd2+和Ca2+,对Na+和Rb+为低亲和吸收。LCT1基因有可能是小麦Na+吸收的重要途径之一,研究LCT1基因的表达模式和功能,对实现小麦和其它作物的抗盐具有重要的意义。本研究对LCT1基因进行了染色体定位,以中国春小麦缺体四体系和双端体系的基因组DNA为模板,采用LCT1基因的特异引物进行PCR扩增,最终确定LCT1基因定位在中国春小麦的1B染色体的长臂上。为了研究LCT1基因的功能和表达,我们根据本实验室已经得到的LCT1基因组序列,利用热不对称交错PCR（Thermal Asymmetric Interlaced PCR,简称TAIL-PCR）的方法克隆小麦LCT1基因的启动子,目前虽然仅得到263bp的核心序列,但分析发现含有启动子的重要元件,如TATA box,MBS,HSE,G-box等。从本实验室已经克隆的中国春小麦LCT1全长cDNA pool中,发现了一种缺少115bp（可能为其内含子）的LCT1剪接变异体序列（命名为LCT1-2）。为了研究LCT1基因的这两种cDNA序列在功能上的差异,分别构建了酵母表达载体和植物表达载体,我们将其转化酵母Na+-extruding ATPase突变体G19（由于编码质膜Na+-extruding ATPase的基因ENA1-ENA4被破坏,因而G19对Na+的敏感性提高）和拟南芥。酵母表达实验结果表明,在含NaCl的培养基上,表达LCT1基因的酵母菌长势明显弱于转空载体的对照菌株G19,表现出对Na+的超敏感性;而表达LCT1-2序列的酵母菌长势很好,并还略好于转空载体的对照菌株,没有体现出对Na+的超敏感性。说明LCT1基因有转运Na+进入细胞的能力,而LCT1-2序列则无此功能。应用农杆菌介导的花器官侵染法将两种cDNA序列转化至哥伦比亚型拟南芥中,已经筛选出T1代转基因后代,为今后的生理生化实验奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 符号说明
• 第一部分 文献综述:高等植物跨膜离子转运蛋白与其耐盐性研究
• +、Na⁺转运蛋白与植物的耐盐性'>一.K⁺、Na⁺转运蛋白与植物的耐盐性
• 1.离子通道
• +通道'>1.1 内向整流K⁺通道
• +通道'>1.2 外向整流K⁺通道
• 1.3 电压不依赖型阳离子通道或非选择性阳离子通道
• 2.离子转运载体
• +载体'>2.1 高亲和性K⁺载体
• 2.2 低亲和性离子转运蛋白
• +/H⁺逆向转运蛋白与耐盐性的关系'>二.植物Na⁺/H⁺逆向转运蛋白与耐盐性的关系
• +/H⁺逆向转运蛋白'>1.植物液泡膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白
• +/H⁺逆向转运蛋白'>2.植物质膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白
• +-ATPase与耐盐性的关系'>三.植物H⁺-ATPase与耐盐性的关系
• 四.结语
• 第二部分 研究工作
• 前言
• 一.材料与方法
• 1.LCT1基因的染色体定位
• 1.1 材料与试剂
• 1.2.实验方法
• 1.2.1 CTAB法提取中国春缺体-四体及双端体小麦叶片基因组DNA
• 1.2.2 引物设计
• 1.2.3 PCR
• 1.2.4 电泳
• 2.克隆LCT1基因启动子
• 2.1 材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 CTAB法提取中国春小麦叶片基因组DNA
• 2.2.2 设计引物
• 2.2.3 TAIL-PCR方法与步骤
• 2.2.4 电泳检测
• 2.2.5 切胶回收
• 2.2.6 回收的目的片段与T载体连接
• 2.2.7 大肠杆菌感受态制备及转化
• 2.2.8 菌体PCR验证
• 2.2.9 送菌测序
• 3.LCT1基因及LCT1-2序列的酵母突变体转化与功能验证实验
• 3.1 材料、试剂与培养基
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 提取重组质粒的大肠杆菌质粒
• 3.2.2 重组质粒的验证
• 3.2.3 酵母感受态制备及转化
• 3.2.4 酵母菌转化重组子的PCR鉴定
• 3.2.5 转化重组子的NaCl培养基上的生长
• 4.LCT1基因及LCT1-2序列转化拟南芥
• 4.1 材料、试剂与培养基
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 提取重组质粒的大肠杆菌质粒
• 4.2.2 重组质粒的验证
• 4.2.3 农杆菌AGL1感受态的制备
• 4.2.4 冻融法转化根癌农杆菌AGL1
• 4.2.5 农杆菌转化子的验证
• 4.2.6 拟南芥转化
• 4.2.7 转基因植株的筛选
• 4.2.8 移栽转基因植株及收获种子
• 二.结果与分析
• 1.LCT1基因的染色体定位
• 1.1 扩增中国春缺体-四体系1号及2号染色体的缺体-四体小麦
• 1.2 扩增中国春缺体-四体系3号、4号及5号染色体的缺体-四体小麦
• 1.3 扩增中国春缺体-四体系6号及7号染色体的缺体-四体系小麦
• 1.4 重新扩增中国春小麦1B1A及1B1D染色体缺体-四体系小麦
• 1.5 扩增中国春1BS及1BL染色体双端体系小麦
• 2.LCT1基因启动子的克隆
• 2.1 TAIL-PCR结果
• 2.2 获得片段的比对结果
• 2.3 应用PlantCARE软件分析核心启动子的结果
• 3.LCT1基因及LCT1-2序列在酵母突变体中的表达
• 3.1 酵母表达载体的验证
• 3.2 酵母转化重组子鉴定
• 3.3 酵母菌转化子在含NaCl培养基上的生长情况实验
• 3.3.1 不同转化子在同一盐浓度下的生长状况
• 3.3.2 同一转化子在不同盐浓度下的生长状况分析
• 3.3.3 综合分析
• 4.LCT1基因及LCT1-2序列转化拟南芥
• 4.1 基因过表达载体的验证
• 4.1.1 重组子中目的基因片段的PCR验证
• 4.1.2 重组子中目的基因片段的酶切验证
• 4.2 转化农杆菌后重组子的验证
• 4.3 拟南芥转化植株的筛选
• 三.讨论
• 1.小麦LCT1基因的定位
• 2.小麦LCT1基因启动子的克隆
• 3.LCT1基因的功能分析
• 四.工作总结与展望
• 参考文献
• 致谢
• 学位论文评阅及答辩情况表