新型稻草还田多功能复合菌系的构建及其功能研究

论文摘要

本文针对水稻秸秆还田后腐解缓慢影响下季作物生长以及秸秆还田后引起土壤中水稻纹枯病病原菌积累两个主要问题，综合利用具有秸秆降解功能的微生物菌群和具有病害生物防治功能的微生物菌株，首先筛选获得一组高效降解水稻秸秆的复合菌群和对水稻纹枯病菌有生物防治功能的高效微生物菌株，然后通过将该纤维素降解菌群和高效生物防治菌株组合的方法，构建兼具加速水稻秸秆降解和抑制水稻病害的多功能复合菌系，并进一步对该复合菌系的功能进行研究，主要研究结果如下：从森林土壤和长期堆放稻草堆土壤中取样，通过采用限制性基质培养，选用稻草失重率、酶活等能够直接表征秸秆腐解程度的参数为筛选指标，经继代培养8代筛选得到一组高效腐解水稻秸秆的复合菌群，该复合菌群对水稻秸秆腐解试验效果表明：pH先降低后升高；CMC酶活和滤纸酶酶活均经历了先升后降的变化趋势，最高酶活分别为15.31IU/ml和1.8IU/ml；发酵结束后，纤维素和半纤维素的降解率分别为46.48%和54.48%，木质素的降解率为4.44%，秸秆重量减少了34%。为了获得适应水稻秸秆还田的抗稻纹枯病菌株，对从土壤分离的4株芽孢杆菌和实验室保藏的9株木霉菌的秸秆利用能力和对稻纹枯病菌株的生物防治功能进行了研究，结果表明芽孢杆菌B4和木霉T3、T5、T6、T9对水稻秸秆有较好的降解效果，芽孢杆菌B4对水稻纹枯病菌的抑制率达到40.48%，而且抑菌带能持久地保持，木霉T3、T5、T6和T9对水稻纹枯病菌的抑制率较高，抑制率分别为46.48%、45.63%、50.99%和53.38%，进一步研究表明这5种拮抗菌的代谢产物都能抑制菌丝的生长和完全阻止菌核的形成。建立了土壤中水稻纹枯病菌数量定量检测的荧光定量PCR方法。针对水稻纹枯病病原菌立枯丝核菌AG-1-IA的ITS序列设计特异引物和Taqman探针，以目标菌株ITS区的阳性克隆质粒作为标准物质，建立标准曲线，并进一步通过在稻田土壤中添加梯度浓度病原菌菌丝体的方法，对该方法的检测精确度进行验证。结果表明，标准曲线的相关系数为0.998，扩增效率为99.7%。对照组无扩增信号，并且土壤样品中病原菌含量的检测值与实际浓度值的相关系数为0.954。表明本实验建立的土壤中水稻纹枯病菌检测方法具有很好的特异性和准确性，可用于土壤中该病原菌宿存数量的检测。通过将具有高效降解纤维素的天然复合菌群与具有抑制水稻纹枯病菌效果的菌株组合，构建多功能复合菌系；采用失重法检测该复合菌系对水稻秸杆的腐解作用，荧光定量PCR法检测其对水稻纹枯病菌的抑制效果。成功地构建了一组多功能复合菌系，腐解12天后，水稻秸秆干物质总失重率为41.4%，其中半纤维素降解率为59.5%，纤维素降解率为52.5%，木质素降解率为15.3%，腐解过程中平均CMC酶活为8.1IU/g。该复合菌系对水稻纹枯病菌的抑制效果明显，发酵40天后对水稻纹枯病菌的抑制率为27.1%，对照组抑制率为2.7%。该复合菌系能高效降解水稻秸秆，同时又能较好地抑制水稻纹枯病菌，适宜在水稻秸秆直接还田过程中使用。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 目录
• 1 文献综述
• 1.1 秸秆利用现状
• 1.1.1 秸秆还田
• 1.1.2 作为生物质能源
• 1.1.3 生产饲料
• 1.1.4 应用于工业生产
• 1.2 秸秆还田效应研究进展
• 1.2.1 秸秆还田对土壤理化性质的影响
• 1.2.2 秸秆还田生物效应
• 1.3 秸秆腐杆剂的研究进展
• 1.4 水稻纹枯病菌的防治进展
• 1.4.1 水稻抗纹枯病的育种与基因工程
• 1.4.2 水稻抗纹枯病化学药剂防治
• 1.4.3 水稻抗纹枯病的生物防治
• 1.5 水稻纹枯病菌定量研究进展
• 1.6 研究目的和意义
• 1.7 研究内容以及技术路线
• 1.7.1 研究内容
• 1.7.2 研究技术路线
• 2 引言
• 3 实验材料
• 3.1 土壤样品的采集
• 3.2 菌株来源
• 3.3 主要仪器设备
• 3.4 培养基
• 4 实验方法
• 4.1 天然复合菌群的筛选
• 4.1.1 菌株的分离
• 4.1.2 复合菌系的筛选过程
• 4.1.3 复合菌系对稻杆的分解特性测定
• 4.2 适应水稻秸秆还田的抗稻纹枯病菌株的筛选
• 4.2.1 菌株的分离
• 4.2.2 降解水稻秸秆芽孢杆菌的筛选
• 4.2.3 降解水稻秸秆木霉菌的筛选
• 4.2.4 纤维素、半纤维素和木质素含量的测定
• 4.2.5 芽孢杆菌对水稻纹枯病菌的抑制效果
• 4.2.6 木霉菌对水稻纹枯病菌的抑制效果
• 4.2.7 芽孢杆菌对水稻秸秆适应性测定
• 4.2.8 木霉菌对水稻秸秆适应性测定
• 4.2.9 菌株鉴定
• 4.3 土壤中水稻纹枯病菌荧光定量 PCR 检测方法的建立与验证
• 4.3.1 CTAB 法提取 DNA
• 4.3.2 ITS 区的克隆
• 4.3.3 序列分析
• 4.3.4 荧光定量 PCR 引物和探针的设计
• 4.3.5 标准品的制备
• 4.3.6 质粒浓度的计算
• 4.3.7 Real-time PCR 反应
• 4.3.8 土壤样品的处理
• 4.3.9 土壤 DNA 的提取
• 4.4 多功能复合菌群功能的研究
• 4.4.1 多功能复合菌群对水稻秸秆的腐解效果测定
• 4.4.2 多功能复合菌群对水稻纹枯病菌的抑制效果测定
• 5 结果与分析
• 5.1 高效降解水稻秸秆天然复合菌群的筛选
• 5.2 复合菌群对稻草降解特性的测定结果
• 5.2.1 降解过程中复合菌的生长曲线
• 5.2.2 降解过程中发酵液的 pH 变化
• 5.2.3 降解稻草过程中酶活的变化
• 5.2.4 降解过程中稻草重量的变化
• 5.2.5 发酵过程中稻草秸秆各成分的变化
• 5.3 降解水稻秸秆菌株的筛选
• 5.4 降解菌对水稻纹枯病菌的抑制效果
• 5.4.1 对峙培养结果
• 5.4.2 降解菌代谢物对纹枯病菌的抑制作用
• 5.5 降解菌对水稻秸秆的适应能力测定结果
• 5.5.1 芽孢杆菌 B4 对水稻秸秆的适应能力测定结果
• 5.5.2 木霉 T3、T5、T6 和 T9 对水稻秸秆的适应能力测定结果
• 5.6 菌株鉴定
• 5.6.1 芽孢杆菌的鉴定
• 5.6.2 木霉菌形态学鉴定结果
• 5.7 水稻纹枯病菌 ITS 区的克隆及序列分析结果
• 5.7.1 ITS 区的克隆
• 5.7.2 序列分析结果
• 5.8 Real-time 引物和探针的设计
• 5.9 标准曲线的绘制
• 5.9.1 标准品的制备与拷贝数的计算结果
• 5.9.2 质粒标准曲线绘制
• 5.10 土壤中稻纹枯病菌荧光定量 PCR 检测方法的精确度验证
• 5.11 多功能复合菌系对稻草的腐解效果
• 5.11.1 复合菌系腐解稻草过程中 CMC 酶活变化
• 5.11.2 复合菌系腐解稻草过程中稻草的失重率
• 5.11.3 复合菌群对稻草不同成份的降解率
• 5.12 多功能复合菌系对水稻纹枯病菌的抑制效果
• 6 讨论
• 7 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简介
• 就读期间发表的学术论文
• 图版 三种木霉菌的菌落特征及显微形态