茶树脱水素基因dhn2的原核表达和体外功能鉴定

论文摘要

脱水素最早发现于20世纪80年代,它是植物中的一类胚胎发育后期丰富蛋白（late embryogenesis abundant proteins, LEA蛋白）,属于LEAD-Ⅱ家族,分子量从9到200KD不等。近年来关于脱水素的研究发展很快,特别是逆境下脱水素对植物的保护作用引起了人们广泛的关注。脱水素富含甘氨酸和赖氨酸,具有很高的亲水性,能与膜脂结合阻止水分过多流失,以保护细胞免受干旱损伤。另外,脱水素还具有蛋白保护能力,其K片段的双亲水a-螺旋结构可以稳定蛋白质结构,起到了类似于分子伴侣的作用。茶树（Camellia sinensis）是一种多年生亚热带经济作物,易遭受冻害。所以茶树抗寒性机制和抗性育种一直受到较多的关注。我们在开展茶树抗寒分子机理研究中,成功构建了低温诱导下茶树的SSH文库,筛选获得一条脱水素基因片段,用RACE试剂盒扩增出基因全长,确认为Sk2型茶树脱水素基因（GenBank登录号GQ228834.1）,并命名为dhn2。为了解茶树脱水素基因dhn2的表达特性与功能,本文以国家品种舒茶早（C. sinensis cv. Shuchazao）为材料,分别进行低温、脱水处理和ABA诱导,用Realtime-PCR技术研究了脱水素基因dhn2在非生物胁迫下的转录变化。同时,对茶树脱水素基因dhn2进行原核表达与鉴定,对融合蛋白进行亲和纯化,鉴定其抗脱水性和抗冻性。这些将为深入研究茶树脱水素的抗逆作用机理提供参考。研究取得以下结果：（1）通过荧光定量PCR技术检测茶树脱水素基因dhn2在不同胁迫条件下的转录方式,发现dhn2基因能被低温,脱水和ABA等非生物胁迫所诱导。其中,低温和干旱胁迫对该基因的诱导作用都较为明显。推测该基因在茶树抗寒和抗旱过程中有着重要的作用。（2）成功构建了茶树脱水素dhn2的原核表达载体,30℃下0.8mmol/L的IPTG诱导4h,脱水素融合蛋白可获得最佳表达；经SDS-PAGE检测,分子量为53KD左右,与预测的基本一致。用Ni2+-NTA亲和层析柱纯化,纯度可达90%。采用Anti-Dehydrin多克隆抗体,融合蛋白经Western blotting检测确定为脱水素。（3）脱水素蛋白体外功能研究表明：脱水处理导致苹果酸脱氢酶丧失了67%的酶活,乳酸脱氢酶经反复冻融后,酶活力损失达到80%。在脱水与冻融处理中脱水素蛋白dhn2对MDH和LDH具有明显的保护作用。当脱水素蛋白与酶蛋比为4时,MDH酶活可保留86%,LDH酶活可保留62%。与常被用作商品酶的稳定剂BSA相比,抗脱水能力较优,而抗冻能力稍低。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 脱水素的结构和分类
• 1.2 脱水素在植物器官,组织和亚细胞中的定位
• 1.3 脱水素功能和可能作用机制
• 1.4 脱水素基因的表达与调控
• 2 引言
• 2.1 研究意义及目的
• 2.2 研究内容
• 2.3 技术路线
• 3 材料与方法
• 3.1 实验材料
• 3.2 仪器与试剂
• 3.3 实验方法
• 4 结果与分析
• 4.1 RNA的提取与质量检测
• 4.2 荧光定量PCR检测
• 4.3 茶树脱水素基因dhn2原核表达载体的构建
• 4.4 茶树脱水素基因dhn2的原核表达
• 4.5 茶树脱水素基因dhn2原核表达的优化
• 4.6 茶树脱水素蛋白dhn2的纯化
• 4.7 茶树脱水素蛋白dhn2的Western blotting鉴定
• 4.8 茶树脱水素蛋白dhn2的体外功能验证
• 5 讨论
• 5.1 改良的试剂盒法提取总RNA
• 5.2 茶树脱水素基因dhn2表达特性分析
• 5.3 茶树脱水素蛋白dhn2的制备
• 5.4 茶树脱水素蛋白dhn2体外功能鉴定方法
• 6 结论
• 6.1 茶树脱水素基因dhn2的表达特性
• 6.2 茶树脱水素基因dhn2的原核表达
• 6.3 茶树脱水素蛋白dhn2体外功能鉴定
• 参考文献
• 附录A 中英文缩写与注释
• 附录B 茶树脱水素dhn2的测序及比对结果
• 附录C 茶树脱水素dhn2蛋白序列比对结果
• 致谢
• 作者简介
• 成果清单