基因枪介导的ScMV-CP基因遗传转化甘蔗研究

基因枪介导的ScMV-CP基因遗传转化甘蔗研究

论文摘要

甘蔗花叶病(Sugarcane Mosaic Disease),是一种严重危害甘蔗生长的病毒性病害,是甘蔗三大病害之一。病发时,造成甘蔗大量减产。全球气温的升高和感病品种的大面积种植,给甘蔗花叶病防治工作增加了压力。目前,传统的耕作措施和化学药剂等方法,还没能有效地起到防治的作用。因此,培育抗病品种成为防治甘蔗花叶病最经济、安全和有效的根本方法。 但是,甘蔗是一种具有高度杂合性的异源多倍体或非整倍体的无性繁殖作物,其遗传背景十分复杂,而且甘蔗抗花叶病遗传是受微效多基因控制的数量性状,抗病育种群体分离十分广泛,这使得通过常规的育种手段很难将抗病与优良品质等目标性状优化聚合。随着现代生物技术的不断创新和发展,转基因技术的日趋完善,利用基因工程进行作物改良,控制作物病毒病害获得了巨大的成功。利用抗病毒基因工程手段将抗病毒基因导入甘蔗,培育甘蔗抗病毒品种技术已日臻成熟。 本研究用基因枪法,将含有甘蔗花叶病外壳蛋白基因的质粒pNUSCP分别转化了福农91-4621、福农95-1702、福农94-0403、桂糖96-211、桂糖96-44、粤糖96-86、粤糖96-794等七个感花叶病的糖蔗品种愈伤组织。优化了福农95-1702和福农94-0403愈伤组织的再生体系,建立了基于上述六个品种(福农91-4621除外)的G418筛选体系,获得了一批抗性再生植株。 主要研究结果如下: 1、对福农95-1702和福农94-0403愈伤组织的再生体系进行优化。采用正交设计方法,研究了6-BA、KT、NAA、活性炭的不同浓度及其组合对这两个甘蔗基因型愈伤组织分化的效果。试验研究结果表明,对于福农95-1702和福农94-0403的愈伤组织分化效果最佳的组合分别是:MS+1.5mg/L6-BA+2.0mg/LKT+0.2mg/LNAA+1.0g/L活性炭和MS+2.5mg/L6-BA+1.5mg/LKT+1.0gm活性炭。 2、建立了甘蔗G418筛选体系。G418对各供试甘蔗愈伤组织的抑制作用相似,愈伤组织生长、分化、生根3个阶段的抗性筛选质量浓度分别为20mg/L~35mg/L、15mg/L~35mg/L和25mg/L。 3、受基因枪轰击的愈伤组织,在含有G418的选择培养基上进行筛选,获得了8株抗性再生植株。分子检测后有3株PCR呈阳性,经Southern杂交分析验证,有1个株系的外源基因以单拷贝形式整合到甘蔗基因组中。

论文目录

  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 一 前言
  • 1 甘蔗花叶病与甘蔗花叶病毒
  • 1.1 甘蔗花叶病的发生情况
  • 1.2 甘蔗花叶病的传播特点
  • 1.3 甘蔗花叶病的症状及危害
  • 1.4 甘蔗花叶病毒
  • 1.4.1 甘蔗花叶病毒株系的分类
  • 1.4.2 甘蔗花叶病毒的分布
  • 1.4.3 甘蔗花叶病毒寄主
  • 1.5 马铃薯Y病毒属基因组结构及其功能
  • 2 植物抗病毒基因工程的策略
  • 2.1 来源于病毒基因介导的抗性
  • 2.1.1 外壳蛋白基因介导的抗性
  • 2.1.2 复制酶基因介导的抗性
  • 2.1.3 运动蛋白介导的抗性
  • 2.1.4 卫星RNA介导的抗性
  • 2.1.5 缺陷干扰型RNA介导的抗性
  • 2.1.6 反义RNA介导的抗性
  • 2.1.7 核酶基因介导的抗性
  • 2.2 非病毒来源的基因介导抗性
  • 2.2.1 病程相关蛋白基因介导的抗性
  • 2.2.2 潜在自杀基因介导的抗性
  • 2.2.3 核糖体失活蛋白基因介导的抗性
  • 2.2.4 植物抗体基因介导的抗性
  • 2.2.5 植物抗病基因介导的抗性
  • 2.3 多基因策略
  • 3 植物抗病毒基因工程的机制
  • 3.1 蛋白质介导的抗性机制
  • 3.2 RNA介导的抗性机制
  • 3.2.1 转录水平的基因沉默机制
  • 3.2.2 转录后基因沉默机制
  • 3.3 RNA介导的抗性与蛋白质介导的抗性差异
  • 4 甘蔗遗传转化的研究进展
  • 4.1 甘蔗遗传转化方法
  • 4.1.1 基因枪介导法
  • 4.1.2 农杆菌介导法
  • 4.1.3 电击介导法
  • 4.2 甘蔗遗传转化的现状
  • 4.2.1 抗病毒基因工程
  • 4.2.2 抗除草剂基因工程
  • 4.2.3 抗虫基因工程
  • 4.2.4 改善品质基因工程
  • 5 本研究的目的和意义
  • 二 材料与方法
  • 1 实验材料
  • 1.1 植物材料
  • 1.2 质粒
  • 1.3 工具酶和试剂盒
  • 1.4 化学试剂与耗材
  • 1.5 主要仪器设备
  • 2 实验方法
  • 2.1 技术路线
  • 2.2 供试植物材料的准备
  • 2.2.1 愈伤组织的诱导
  • 2.2.2 愈伤组织的继代
  • 2.2.3 愈伤组织的分化
  • 2.2.4 分化苗的生根
  • 2.3 甘蔗再生体系的优化
  • 2.3.1 愈伤组织的诱导和继代
  • 2.3.2 试验设计
  • 2.4 甘蔗G418筛选体系的建立
  • 2.4.1 继代培养阶段的G418抗性试验
  • 2.4.2 分化培养阶段的G418抗性试验
  • 2.4.3 生根培养阶段的G418抗性试验
  • 2.5 基因枪介导的甘蔗遗传转化
  • 2.5.1 质粒DNA的大量提取、纯化与鉴定
  • 2.5.2 转化材料的轰击
  • 2.5.3 愈伤组织的筛选和抗性植株的再生
  • 2.5.4 抗性植株的炼苗和移栽
  • 2.5.5 抗性植株的分子鉴定
  • 三 结果与分析
  • 1 甘蔗再生体系的优化
  • 1.1 各因素对愈伤组织分化的影响
  • 1.1.1 各因素对分化效率的影响大小
  • 1.1.2 各因素不同浓度对愈伤组织分化的影响
  • 1.1.3 优化配方的获得
  • 1.2 优化配方与原有再生体系的比较
  • 2 甘蔗G418筛选体系的建立
  • 2.1 G418对甘蔗愈伤组织生长的抑制作用
  • 2.2 G418对甘蔗愈伤组织分化的抑制作用
  • 2.3 G418对甘蔗分化苗生根的抑制作用
  • 3 ScMV-CP基因遗传转化甘蔗研究
  • 3.1 质粒提取和鉴定结果
  • 3.2 基因枪转化和筛选的再生植株结果
  • 3.3 转化植株的分子鉴定
  • 3.3.1 PCR检测结果
  • 3.3.2 PCR-Southern杂交结果
  • 3.3.3 基因组Southern杂交结果
  • 四 讨论
  • 1 关于甘蔗再生体系的优化
  • 2 关于甘蔗G418筛选体系的建立
  • 3 关于基因枪法应用中的问题
  • 4 关于外壳蛋白基因介导的抗性机制
  • 5 关于利用基因工程技术创造转基因甘蔗的可行性
  • 6 关于后续工作
  • 五 结论
  • 1 优化了两个糖蔗品种(系)的再生体系
  • 2 建立了六个糖蔗品种(系)的G418筛选体系
  • 3 尝试用基因枪法将ScMV-CP基因导入糖蔗中
  • 六 在学期间发表的论文情况
  • 参考文献
  • 附录Ⅰ 缩略词及英汉对照
  • 附录Ⅱ MS培养基配方及其母液的配制
  • 附录Ⅲ 主要溶液的配制
  • 致谢
  • 相关论文文献

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