重寄生真菌盾壳霉降解草酸毒素及其引起的生防效应研究

论文摘要

由核盘菌[Sclerotinia sclerotiorum（Lib.）de Bary]引起的油菜菌核病是一种世界性分布的重要病害。重寄生真菌盾壳霉（Coniothyrium minitans）是核盘菌的一种具有广阔应用前景的生防菌。前人对盾壳霉防治核盘茵的机制和防病潜力已进行了深入研究。这些机制主要侧重于盾壳霉对核盘菌的重寄生作用,竞争作用和抗真菌作用,而对其降解核盘菌产生的草酸毒素及其产生的一系列生防效应则未见报道。草酸（Oxalic acid,OA）是核盘菌产生的一种毒素,在核盘菌的致病过程中起着决定因子的作用。盾壳霉可以寄生核盘菌的菌落以及核盘菌引起的病斑,可见盾壳霉可以抵抗一定浓度的草酸。这种抗性的本质是什么?本研究从盾壳霉降解草酸的角度出发,对盾壳霉降解草酸的能力和影响因子,以及由此产生的生防效应进行了研究,旨在发掘盾壳霉防治核盘菌的新因子,以及增强盾壳霉防治油菜菌核病的效果及稳定性。取得了如下研究结果:首先,对盾壳霉降解草酸的能力进行了定量分析。结果表明:在含有0.8～32mmol/L草酸的改良马铃薯葡萄糖培养液（mPDB）中培养盾壳霉15d（20℃）,培养液中的草酸含量下降85.9%～91.7%。这些盾壳霉培养物滤液的pH值从酸性水平（pH2.9～6.3）升高至弱碱性水平（pH7.7～8.6）。此外,从这些盾壳霉培养物滤液中还检测出氨。产生氨可能是引起培养液pH值升高的另一个原因。而当mPDB中的草酸浓度达到40和80mmol/L时,盾壳霉不能生长,培养液中的草酸含量没有发生明显下降。在另一个试验中,以含有16mmol/L草酸的mPDB培养盾壳霉（20℃,15d）,分别测定培养液和盾壳霉菌丝中的草酸含量,结果表明:培养液中草酸含量下降88.0%,菌丝提取物中没有检测到草酸的存在。由此证明盾壳霉具有降解草酸的能力。将油菜幼苗的根浸泡在盾壳霉培养物滤液中,测定其中的毒性。结果表明:盾壳霉在含有草酸（8、16、24、32mmol/L）的培养液中生长后（20℃,15d）,滤液的毒性显著降低,进一步证实盾壳霉具有解除草酸毒害作用的能力。进一步定量分析表明:盾壳霉降解草酸与盾壳霉菌丝有关。其证据包括:（1）盾壳霉培养物（mPDB+16mmol/L OA,20℃,9d）滤液（无菌丝细胞）对草酸（8mmol/L）没有降解作用,这说明滤液中不存在降解草酸的活性物质或活性物质的含量很低:（2）在盾壳霉培养物（mPDB+16mmol/L OA,20℃,9d）中继续添加草酸（16mmol/L）,再分成两种处理,一种处理是补充营养物质（0.1%KNO3和0.5%葡萄糖,w/v）,另一种处理不添加任何营养物质,继续振荡培养（20℃,200r/min,9d）,结果表明:补充营养物质处理的草酸降解较不加营养物质处理明显提前。这说明盾壳霉菌丝生长与降解草酸是同步进行的。从盾壳霉菌丝中检测到草酸脱羧酶活性。其次,对影响盾壳霉降解草酸的因子进行了研究。结果表明:酸性环境对盾壳霉降解草酸根离子十分重要。在mPDB培养液中添加草酸钠（16mmol/L）后,培养液的pH值为6.4,添加草酸铵（16mmol/L）后,pH值为6.2。盾壳霉在这两种培养液中生长后对草酸根离子的降解率低于5%。在含草酸钠或草酸铵的培养液中添加草酸（16mmol/L）后,培养液的pH值下降至3.5～3.6。盾壳霉在这两种培养液中生长后,对草酸根离子的降解率上升至14.1%（草酸钠处理）或36.1%（草酸铵处理）。在含草酸钠或草酸铵的培养液中添加盐酸（0.2%,v/v）后,培养液的pH值下降至2.8～2.9。盾壳霉在这两种培养液中生长后,对草酸根离子的降解率上升至63.0%（草酸钠处理）或89.5%（草酸铵处理）。另一方面,用NaOH（1mol/L）调节含草酸（8、16、24、32mmol/L）的mPDB至pH7.0时,盾壳霉生长后降解草酸的能力显著降低。影响盾壳霉降解草酸效率的另一个因子是草酸浓度。在草酸浓度为8～32mmol/L范围内,草酸浓度愈高,降解速度愈慢,反之亦然。当浓度高于40mmol/L时,盾壳霉不能生长,因而不能降解草酸。比较了两个培养特性（色素产生、双链RNA有无和液体产孢）差别较大的盾壳霉菌株（Chy-1和ZS-1）降解草酸的能力。结果表明:这两个盾壳霉菌株降解草酸的能力没有显著差异。以查比培养液为基础培养基研究了5种碳源（葡萄糖、果糖、麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉）和4种氮源（硝酸钾、硝酸铵、丙氨酸、谷氨酸）对盾壳霉降解草酸的影响。结果表明:供试5种碳源和3种氮源（硝酸钾、丙氨酸和谷氨酸）均有利于盾壳霉菌丝生长,因而降解草酸的效率较高（＞98%）。而硝酸铵不利于盾壳霉菌丝生长,因而草酸降解效率较低（46.1%）。在核盘菌菌核提取物或菌丝提取物中添加草酸（8mmol/L或16mmol/L）,接种盾壳霉,振荡培养（20℃,200r/min,15d）后培养液中的草酸全部被盾壳霉降解。第三,研究了盾壳霉降解草酸对其产生重寄生相关的胞外酶（β-1,3-葡聚糖酶、几丁质酶和蛋白酶）的影响、对这些胞外酶活性的影响以及对产生抗真菌物质的影响。结果表明:盾壳霉降解草酸后,引起环境pH升高,有利于盾壳霉产生这三种重寄生相关酶,并提高这些酶的活性。说明降解草酸有利于盾壳霉寄生核盘菌。另一方面,草酸可以诱导盾壳霉产生抑制核盘菌菌丝生长的抗真菌物质（Anti-fungalsubstance,简称AFS）。盾壳霉产生AFS的量与培养液（PDB）中的初始草酸浓度（8～32mmol/L）呈正相关（P＜0.05）,而与盾壳霉降解草酸的效率呈负相关（P＜0.01）。而在PDB培养液中添加草酸钠时（8～32mmol/L）,盾壳霉培养液的AFS活性低。说明草酸营造的酸性环境是诱导盾壳霉产生AFS的原因。基于上述研究结果,可以看出草酸在盾壳霉与核盘菌互作中扮演着重要角色—调控盾壳霉的抗真菌作用和重寄生作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表（Abbreviation）
• 第一章 文献综述
• 1 核盘菌的研究进展
• 1.1 核盘菌的形态和基本生物学特性
• 1.2 油菜菌核病的症状和发病规律
• 1.3 核盘菌的侵染过程
• 1.4 核盘菌的主要致病因子
• 1.4.1 细胞壁降解酶
• 1.4.2 毒素
• 1.5 核盘菌的防治策略
• 2 草酸毒素的研究进展
• 2.1 植物病原毒素概述
• 2.2 草酸
• 2.2.1 草酸概述
• 2.2.2 草酸的合成与分解
• 2.2.3 草酸在核盘菌致病过程中的作用
• 2.2.4 草酸在核盘菌病害流行预测和防治中的作用
• 3 盾壳霉的研究进展
• 3.1 盾壳霉的生物学及生态学特性
• 3.2 盾壳霉防治核盘菌的主要机制
• 3.2.1 重寄生作用
• 3.2.2 抗生作用
• 3.2.3 溶菌作用
• 3.3 盾壳霉产生的与重寄生作用相关的主要胞外酶
• 3.4 盾壳霉的遗传改良
• 3.5 盾壳霉的应用前景
• 4 本研究的意义和主要研究内容
• 4.1 课题的意义
• 4.2 课题的研究内容
• 第二章 盾壳霉对草酸毒素的降解作用
• 1 材料与方法
• 1.1 材料,培养基和仪器设备
• 1.2 盾壳霉降解不同浓度草酸的定量测定
• 1.2.1 草酸的提取和含量测定
• 1.2.2 氨含量的测定
• 1.2.3 盾壳霉菌丝中草酸的测定
• 1.3 盾壳霉降解草酸的时间动态
• 1.4 盾壳霉降解草酸的生物测定
• 1.5 盾壳霉与核盘菌在PDA培养基上互作所引起的pH值变化
• 1.6 盾壳霉与核盘菌在油菜花瓣上互作所引起的pH值变化
• 1.7 盾壳霉在油菜组织上对草酸的降解
• 1.8 盾壳霉降解草酸过程的初步定位
• 1.9 盾壳霉产生的草酸脱羧酶活性检测
• 1.10 数据统计分析
• 2 结果与分析
• 2.1 盾壳霉对不同浓度草酸的降解作用
• 2.2 盾壳霉降解不同浓度草酸的时间动态
• 2.3 盾壳霉降解草酸的生物测定
• 2.4 盾壳霉与核盘菌在PDA培养基上共培养所引起的pH值变化
• 2.5 盾壳霉与核盘菌在油菜花瓣上所引起的pH值变化
• 2.6 盾壳霉在油菜组织上对草酸的降解
• 2.7 盾壳霉降解草酸过程的初步定位
• 2.8 盾壳霉中草酸脱羧酶活性检测
• 3 讨论
• 第三章 影响盾壳霉降解草酸毒素的因子
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株与培养条件
• 1.2 不同盾壳霉菌株降解草酸的能力比较
• 1.3 培养基碳源和氮源对盾壳霉降解草酸的影响
• 1.3.1 试验一:碳源对盾壳霉降解草酸的影响
• 1.3.2 试验二:氮源对盾壳霉降解草酸的影响
• 1.3.3 试验三:核盘菌菌核或菌丝提取物对盾壳霉降解草酸的影响
• 1.4 酸性环境对盾壳霉降解草酸的影响
• 1.4.1 试验一:盾壳霉降解草酸盐的效率
• 1.4.2 试验二:酸性条件下盾壳霉降解草酸盐的效率
• 1.4.3 试验三:中性pH条件下盾壳霉降解草酸的效率
• 1.5 数据统计分析
• 2 结果与分析
• 2.1 不同盾壳霉菌株降解草酸的能力比较
• 2.2 几种碳源和氮源对盾壳霉降解草酸的影响
• 2.2.1 试验一:不同碳源对盾壳霉降解草酸能力的影响
• 2.2.2 试验二:不同氮源对盾壳霉降解草酸能力的影响
• 2.2.3 试验三:核盘菌菌核或菌丝提取物对盾壳霉降解草酸的影响
• 2.3 酸性环境对盾壳霉降解草酸的重要性
• 2.3.1 试验一:盾壳霉降解草酸盐的效率
• 2.3.2 试验二:酸性条件下盾壳霉降解草酸盐的效率
• 2.3.3 试验三:中性pH条件下盾壳霉降解草酸的效率
• 第四章 盾壳霉降解草酸对葡聚糖酶产生及活性的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株与培养条件、仪器、试剂
• 1.2 盾壳霉产生的β-1,3-葡聚糖酶的定量检测
• 1.3 被盾壳霉寄生的核盘菌菌核中的β-1,3-葡聚糖酶产量测定
• 1.4 草酸对盾壳霉葡聚糖酶产生的影响
• 1.5 环境pH值对盾壳霉葡聚糖酶产生的影响
• 1.6 盾壳霉与核盘菌互作时β-1,3-葡聚糖酶的产生
• 1.7 草酸对盾壳霉葡聚糖酶活性的影响
• 1.8 草酸钠对盾壳霉β-1,3-葡聚糖酶活性的影响
• 1.9 环境pH值对盾壳霉葡聚糖酶活性的影响
• 1.10 数据统计分析
• 2 结果与分析
• 2.1 盾壳霉寄生核盘菌菌核时产生β-1,3-葡聚糖酶
• 2.2 草酸对盾壳霉β-1,3-葡聚糖酶产生的影响
• 2.3 环境pH值对β-1,3-葡聚糖酶产生的影响
• 2.4 盾壳霉与核盘菌互作时β-1,3-葡聚糖酶的产生
• 2.5 草酸和草酸钠对葡聚糖酶活性的影响
• 2.6 环境pH值对葡聚糖酶活性的影响
• 3 讨论
• 第五章 盾壳霉降解草酸对几丁质酶产生及活性的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株与培养条件
• 1.2 盾壳霉降解草酸对其产生几丁质酶的影响
• 1.3 盾壳霉几丁质酶活性的测定方法
• 1.3.1 胶态几丁质的制备
• 1.3.2 N-乙酰氨基葡萄糖标准曲线的绘制
• 1.3.3 几丁质酶活力测定
• 1.4 培养液pH值对盾壳霉产生几丁质酶的影响
• 1.5 草酸对盾壳霉几丁质酶活性的影响
• 1.5.1 盐析浓缩酶蛋白
• 1.5.2 透析去盐
• 1.5.3 草酸对盾壳霉几丁质酶活性的影响
• 1.6 pH值对盾壳霉几丁质酶活性的影响
• 1.7 数据统计分析
• 2 结果与分析
• 2.1 草酸对盾壳霉几丁质酶产量的影响
• 2.2 环境pH值对盾壳霉几丁质酶产生的影响
• 2.3 草酸对盾壳霉几丁质酶活性的影响
• 2.4 pH值对盾壳霉几丁质酶活性的影响
• 3 讨论
• 第六章 盾壳霉降解草酸对蛋白酶产生及活性的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株与培养条件
• 1.2 蛋白酶活性的测定
• 1.3 被盾壳霉寄生致腐的核盘菌菌核中的蛋白酶活性测定
• 1.4 草酸和草酸钠对盾壳霉蛋白酶产生的影响
• 1.5 环境pH值对盾壳霉产生蛋白酶的影响
• 1.6 草酸和草酸钠对盾壳霉蛋白酶活性的影响
• 1.7 环境pH值对盾壳霉蛋白酶活性的影响
• 1.8 数据统计分析
• 2 结果与分析
• 2.1 被盾壳霉寄生致腐的核盘菌菌核中的蛋白酶活性
• 2.2 草酸和草酸钠对盾壳霉产生蛋白酶的影响
• 2.3 环境pH值对盾壳霉产生蛋白酶的影响
• 2.4 草酸和草酸钠对盾壳霉蛋白酶活性的影响
• 2.4.1 试验一:检测盾壳霉寄生致腐的核盘菌菌核中的蛋白酶活性
• 2.4.2 试验二:检测盾壳霉PDA培养物中的蛋白酶活性
• 2.5 环境pH值对盾壳霉蛋白酶活性的影响
• 3 讨论
• 第七章 盾壳霉降解草酸对其产生抗真菌物质的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株与培养条件
• 1.2 草酸和草酸钠对盾壳霉产生AFS的影响
• 1.3 在含草酸或草酸钠的培养液中AFS产生的时间动态
• 1.4 环境pH值对盾壳霉AFS活性的影响
• 1.5 数据统计分析
• 2 结果与分析
• 3 讨论
• 第八章结论与展望
• 一、结论
• 二、展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录 常用培养基和试剂配方