氯化锂介导Wnt/β-catenin信号对经血源性间充质干细胞增殖与分化的调控

论文摘要

干细胞是一类具有自我更新、高度增殖和分化潜能的细胞群体,由于其独特的生物学特征和功能,已成为现代生物学发展迅速且广受关注的领域,干细胞在再生医学的应用潜力也日益得到重视。然而,目前制约干细胞推广应用的瓶颈问题是如何获得适合临床应用的干细胞来源和充足的细胞量,如何能够定向诱导分化。近年来国外学者从女性经血中分离出间充质干细胞（menstrual blood-derived mesenchymal stem cells,MMCs）,不仅克服了胚胎干细胞（embryonic stem cells, ESC）来源和伦理之争,也缓解了骨髓干细胞（bone marrow stem cells, BMSCs）经创伤途径获取和细胞数量有限的局限性。这种新型干细胞表达干细胞的基本表面标志物,免疫源性低,具有自我更新和多向分化潜能,体外采用特定的诱导剂处理后可以分化为神经元样细胞,为中枢神经系统疾病的治疗带来希望。然而,国内未见相关研究报道。干细胞发育受多条信号通路的共同参与,其中Wnt/β-catenin信号通路通过影响下游靶基因的表达变化调控干细胞的增殖与分化。有研究报道胚胎干细胞、骨髓、脐血间充质干细胞中Wnt/β-catenin信号的存在,可以通过添加外源性Wnt蛋白启动或通过抑制GSK-3β、APC等信号通路成分的活性间接激活Wnt信号,而在国内外此信号通路如何调控MMCs的生物学行为均未见相关报道。近年来研究发现,临床常规治疗躁狂或抑郁症等精神性疾病的药物锂盐能够刺激干细胞增殖,当干细胞培养基中添加氯化锂时,能抑制经典Wnt信号通路中GSK-3β的激酶活性,阻碍GSK-3β介导的β-catenin磷酸化,导致β-catenin的核内积累,进而激活Wnt/β-catenin信号通路。因此,氯化锂是GSK-3β的抑制剂。本实验在成功分离、培养MMCs的基础上,采用氯化锂作用于增殖和诱导分化后的MMCs,RT-PCR和western blot分别检测MMCs中β-catenin的表达量,探索氯化锂是否通过介导Wnt/β-catenin信号通路调控MMCs的增殖和分化。本论文共分为三部分,第一部分：MMCs的分离、培养及鉴定；第二部分：体外诱导MMCs神经元样细胞分化；第三部分：氯化锂对MMCs中Wnt/β-catenin信号通路成员β-catenin的影响。第一部分：本课题所用经血均为健康女性志愿者提供。采用Ficoll淋巴细胞分离液,密度梯度离心法收集经血单个核细胞贴壁培养,多次换液弃去悬浮生长的血细胞,利用间充质干细胞较单核细胞易脱落的特点,传代纯化扩增细胞；采用CCK-8法测定并绘制细胞增殖曲线；流式细胞术检测MMCs表面分子标记。实验结果表明：经血中存在间充质干细胞,且能稳定传代培养；细胞增殖活力强,P10代与P3代MMCs的增殖速率没有较大改变；MMCs表达间充质干细胞表面标记如CD29、CD44,不表达造血干细胞标记物CD34和泛白细胞标记物CD45, HLA-ABC低表达,几乎不表达HLA-DR,说明免疫源性较低；第二部分：免疫细胞化学检测MMCs中是否存在神经前体细胞；采用bFGF预诱导24h,β-巯基乙醇和DMSO联合诱导MMCs10h向神经元样细胞分化。用RT-PCR检测神经干细胞标志物巢蛋白（Nestin）、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、神经丝蛋白（NF）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）mRNA的表达情况,并采用免疫细胞化学方法鉴定诱导后MMCs是否表达神经元特异标志基因NSE、NF。结果表明诱导前MMCs出现Nestin阳性染色,证实MMCs中有神经前体细胞的存在。诱导后MMCs能特异性表达NSE、NF,不表达GFAP,证明诱导后的细胞是神经元细胞,而不是神经胶质细胞。NF、NSE mRNA表达量随诱导时间的延长逐渐增强,可能与神经元分化的进行有关。第三部分：在DMEM高糖培养基中分别加入不同浓度（2,4,8,10,20,40mmol/L）的氯化锂,并持续处理MMCs 4d,进行形态学观察；CCK-8法检测MMCs增殖情况；RT-PCR、western blot分别检测氯化锂处理前后MMCs中β-catenin在mRNA和蛋白水平的表达变化；另在神经元诱导培养基中4 mmol/L氯化锂处理MMCs4d,以检测MMCs分化后β-catenin基因的表达变化。结果发现在4d的培养条件下,低浓度氯化锂（4 mmol/L）促进MMCs增殖,高浓度氯化锂（10 mmol/L以上）反而抑制MMCs增殖,表明氯化锂能激活Wnt/β-catenin信号通路,却存在剂量依赖性。4 mmol/L氯化锂能明显提高MMCs中β-catenin蛋白的表达量,对诱导后MMCs中(β-catenin的表达量也有一定影响。总之,本实验在国内首次分离、培养并鉴定了MMCs,并且MMCs具有神经分化潜能。用不同浓度氯化锂作用细胞后发现,4mmol/L氯化锂是促进MMCs增殖的最佳浓度,氯化锂可以增加β-catenin的表达量,从而表明氯化锂激活了Wnt/β-caten in信号通路。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩略表
• 引言
• 第一部分:经血间充质干细胞的分离、培养与鉴定
• 前言
• 1 材料与方法
• 1.1 标本来源
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要试剂的配制
• 1.4 MMCs的原代分离、培养与鉴定
• 1.5 CCK-8法检测人MMCs增殖情况
• 2 结果
• 2.1 MMCs形态学观察
• 2.2 流式细胞术鉴定MMCs表面标志物
• 2.3 MMCs的生长曲线检测
• 3 讨论
• 3.1 MMCs的来源争议
• 3.2 多种因素对细胞生长的影响
• 3.3 细胞增殖活力的比较
• 小结
• 参考文献
• 第二部分:体外诱导经血间充质干细胞神经元样细胞分化
• 前言
• 1 材料与方法
• 1.1 标本来源
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要试剂的配制
• 1.4 免疫细胞化学检测MMCs中神经干细胞标记物nestin
• 1.5 体外诱导MMCs神经细胞分化
• 2 结果
• 2.1 MMCs中nestin表达检测
• 2.2 MMCs向神经元样细胞分化的相关检测
• 3 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第三部分:氯化锂介导Wnt/β-catenin分子信号对MMCS增殖与分化的影响
• 前言
• 1 材料与方法
• 1.1 标本来源
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要试剂的配制
• 1.4 LiCl处理MMCs
• 1.5 LiCl处理后MMCs的神经元诱导分化
• 1.6 统计学分析
• 2 结果
• 2.1 不同浓度LiCl处理MMCs后形态学观察
• 2.2 不同浓度LiCl对MMCs的增殖作用
• 2.3 4mmol/L LiCl对MMCs分化的影响
• 3 讨论
• 小结
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 个人简历
• 攻读硕士期间发表的论文
• 发明专利
• 附录
• 致谢