烟草TM2序列在转基因植物中的应用与功能分析

论文摘要

植物基因工程研究为培育作物优良新品种开辟了一条新的路径,植物转基因技术作为植物基因工程的关键组成部分已经成为改良作物品种的重要手段。一个优秀的转基因植物我们首先希望它的外源基因能够按照设计要求有效的进行表达,但是转基因沉默现象的发生使基因的商品化进程受到了严重的影响。因此,提高外源基因的表达水平、减少转基因沉默的发生是一个亟待解决的问题。以往研究者往往通过去甲基化或者是改变启动子等方式来试图减少转基因沉默现象的发生,这些措施都取得了一定的效果,但不是十分理想。近些年来,研究者开始试图从染色质结构的调控水平上来破解转基因沉默的秘密,因此,把基因组DNA和染色质骨架/核骨架联系起来的核基质结合序列的研究逐渐受到了研究者的重视。核基质结合序列（Matrix Attachment Regions,MARs）是真核生物基因组上一段富含A/T的序列,通过与染色质结合,MARs之间的染色质区域会形成染色质环,每一个环为一个独立的结构单位和基因表达调控单位。TM2是本实验室从烟草核基质中分离得到的一个具有一般MARs结构特征的DNA序列,核基质体外结合实验证明TM2与水稻核基质具有很强的体外结合能力。为了验证TM2在植物体内的功能,我们构建不同的植物表达载体转化了烟草和水稻,对转基因植株中TM2连接的外源基因的表达情况进行了分析。为了进一步研究TM2的作用机理,本试验还对TM2进行了序列的缺失分析以及转基因植株T-DNA的插入位点分析,主要试验结果如下:1.通过体内核基质结合序列的分离,首先从烟草中分离得到了一些含有核基质结

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 1.1 转基因技术存在的问题及解决办法
• 1.1.1 转基因沉默及其产生原因
• 1.1.2 消除转基因沉默的方法
• 1.2 核基质结合序列在转基因中的作用及研究现状
• 1.2.1 细胞核与核基质
• 1.2.2 染色质状态与Loop 环模型
• 1.2.3 核基质结合序列（MARs）与染色体Loop结构
• 1.2.4 核基质结合序列（MARs）的分离与鉴定
• 1.2.5 核基质结合序列（MARs）的结构特征
• 1.2.6 核基质结合序列（MARs）的结合蛋白
• 1.2.7 核基质结合序列（MARs）对外源基因表达的影响
• 1.2.8 核基质结合序列（MARs）的核基质体外结合能力与体内功能的关系
• 1.2.9 核基质结合序列（MARs）作用的分子机理
• 1.3 本课题的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株与质粒
• 2.1.3 酶与各种生化试剂
• 2.1.4 实验用的引物和寡核苷酸
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 烟草核基质结合序列的分离
• 2.2.2 烟草核基质结合序列与水稻核基质的体外结合试验
• 2.2.3 植物表达载体的构建
• 2.2.4 植物表达载体的转化
• 2.2.5 转基因植物的GUS表达分析
• 2.2.6 转基因植物的Northern 杂交分析
• 2.2.7 转基因植物的Southern 杂交分析
• 2.2.8 棉花GhNHX1基因在水稻中的作用分析
• 2.2.9 TM2转基因水稻植株T-DNA插入位点分析
• 3 结果与分析
• 3.1 TM2序列是能与烟草核基质进行较强体外结合的序列
• 3.1.1 烟草核基质结合序列的分离
• 3.1.2 TM2克隆的获得
• 3.1.3 烟草核基质结合序列TM2的序列测定及结构分析
• 3.1.4 TM2序列与水稻核基质的体外结合试验
• 3.2 TM2 在转基因植物体内的功能鉴定
• 3.2.1 TM2在转基因双子叶植物烟草中提高外源gusA基因的表达水平
• 3.2.2 TM2序列在转基因单子叶作物水稻中提高外源gusA基因的表达水平
• 3.2.3 TM2 能够提高转基因水稻的耐盐性
• 3.2.4 TM2 提高水稻转化频率
• 3.3 TM2 的作用机理研究
• 3.3.1 TM2序列在表达核的单端与双端对外源GUS 基因表达的影响
• 3.3.2 TM2转基因植株中NPTII抗性基因的表达增强
• 3.3.3 TM2 重要功能序列的缺失分析
• 3.3.4 TM2 转基因水稻植株T-DNA 插入位点分析
• 4 讨论
• 4.1 TM2在单子叶植物和双子叶植物中都能提高外源基因表达
• 4.2 TM2的作用依赖于启动子类型，但不能改变启动子的作用模式
• 4.3 TM2在单子叶植物和双子叶植物中都能提高转化频率
• 4.4 TM2的核心作用序列分析结果
• 4.5 TM2在异染色质区也能提高基因表达
• 4.6 研究设想
• 4.7 TM2的应用前景
• 5 结论
• 6 参考文献
• 7 附录
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文情况