蟛蜞菊抗肿瘤有效部位的分离及其作用机制的研究

论文摘要

中药蟛蜞菊为菊科（Compositae）蟛蜞菊属（Wedelia）植物蟛蜞菊（W.chinensis）的干燥全草,在我国南方民间应用广泛。尽管研究表明蟛蜞菊具有清热解毒、抗菌消炎、保肝利胆和消肿止痛等多种药理活性,然而,对蟛蜞菊的抗肿瘤作用及其分子机制研究却鲜有报道。本文采取传统的化学提取分离与体外MTT活性筛选相结合的方法,筛选并确定蟛蜞菊抗肿瘤的有效部位,进而研究有效部位对肿瘤细胞增殖、细胞凋亡和细胞周期的作用,最后通过RNA干扰、Real-time PCR和RT-PCR等方法研究有效部位抗肿瘤的分子机制。研究目的:本文对蟛蜞菊进行提取和分离,明确其抗肿瘤的有效部位,并对有效部位抗肿瘤作用的分子机制进行初步探讨,为蟛蜞菊的开发和应用提供实验依据。研究方法:1.采用传统的中药水提及醇提方法,分别以水、70%乙醇和95%乙醇作为提取溶剂对干燥的蟛蜞菊全草进行提取,最终得到蟛蜞菊水提物浸膏、蟛蜞菊70%乙醇提取浸膏和蟛蜞菊95%乙醇提取浸膏。2.采用经典的MTT实验,分别用蟛蜞菊水提物浸膏、蟛蜞菊70%乙醇提取浸膏和蟛蜞菊95%乙醇提取浸膏作用人鼻咽癌细胞CNE-1、人卵巢癌细胞HO-8910、人肝癌细胞Bel-7402、人肺癌细胞A549及人恶性黑色素瘤细胞A375,筛选出抗肿瘤作用最明显的提取物浸膏和对其作用最敏感的肿瘤细胞。3.两相溶液萃取法对提取物浸膏进行萃取,分别得石油醚萃取相、乙酸乙酯萃取相和正丁醇萃取相,结合MTT实验筛选出抗肿瘤作用最强的萃取相,即为蟛蜞菊抗肿瘤初级有效部位。4.对初级有效部位进行硅胶色谱柱层析,选用氯仿-甲醇洗脱系统进行梯度洗脱,结合薄层层析检测合并洗脱溶液,获得各次级部位,采用MTT法检测各次级部位抑制肿瘤细胞增殖的活性,最终获得蟛蜞菊抗肿瘤的有效部位。5.采用流式细胞术检测蟛蜞菊有效部位对肿瘤细胞周期及细胞凋亡的影响。6. Hoechst染色后荧光显微镜观察蟛蜞菊有效部位诱导细胞凋亡的作用。7.采用RNA干扰的方法抑制Chk1和Chk2基因的表达,通过Real-time PCR和RT-PCR以GADpH基因为内参对抑制效果进行检测,确定si-Chk1和si-Chk2能分别有效抑制Chk1和Chk2基因的表达。8.采用MTT法和流式细胞术分别检测抑制Chk1和Chk2基因表达后,蟛蜞菊有效部位对肿瘤细胞增殖的抑制作用和对细胞周期的影响。9. RT-PCR检测抑制Chk1和Chk2基因表达后,蟛蜞菊有效部位对c-myc、cyclin B1和cyclin D1基因表达的影响。结果:1.采用经典的MTT法系统地研究了蟛蜞菊醇提物和水提物对多种肿瘤细胞的增殖抑制作用,结果表明二者对多种肿瘤细胞均有不同程度的生长抑制作用;同时,蟛蜞菊70%醇提物比水提物及95%醇提取物对多种肿瘤细胞生长的抑制作用更强。进一步MTT结果显示,蟛蜞菊70%乙醇提取物对CNE-1细胞的抑制作用最强,半数抑制浓度(IC50)为1.27±0.19 mg/ml。因此,蟛蜞菊70%乙醇提取物是抗肿瘤作用最强的提取物,人鼻咽癌细胞CNE-1是对其作用最敏感的肿瘤细胞。2.通过两相溶液萃取法对蟛蜞菊70%乙醇提取物进行萃取后得到石油醚萃取相、乙酸乙酯萃取相、正丁醇萃取相和水相,经MTT法筛选后发现乙酸乙酯萃取相比其他各萃取相具有更显著的细胞增殖抑制作用,其半数抑制浓度(IC50)为542.68±47.09μg/ml,明显低于其他萃取相。因此,蟛蜞菊70%乙醇提取物乙酸乙酯萃取相为体外抗肿瘤的初级有效部位。3.对乙酸乙酯萃取相进行硅胶色谱柱层析后共得到6个次级部位（EA1、EA2、EA3、EA4、EA5和EA6）。通过MTT法检测EA1-6对CNE-1细胞增殖的抑制作用,结果发现100%甲醇洗脱部位EA6对CNE-1细胞增殖的抑制作用最强,其半数抑制浓度(IC50)较其他洗脱部位明显降低,仅为96.59±19.37μg/ml,且呈现出良好的剂量和时间依赖关系。据此,确定EA6为蟛蜞菊抗肿瘤的有效部位。4.通过流式细胞术及Hoechst染色法检测EA6对CNE-1细胞凋亡及细胞周期的影响。结果显示,EA6作用24 h后可引起CNE-1细胞大量阻滞在G2/M期,G2/M期细胞数从对照组的（17.14±0.85）%上升至（44.83±6.43）%;EA6作用48 h后G2/M期细胞数从（18.96±3.78）%上升至（39.57±1.58）%;EA6作用48 h后可诱导部分CNE-1细胞发生细胞凋亡,凋亡率由对照组的（0.6±0.1）%上升至（12.3±2.51）%。5. EA6可诱导CNE-1细胞发生明显的G2/M期阻滞,通过RNA干扰的方法抑制Chk1的表达后,EA6诱导的细胞G2/M期阻滞的现象也随之消失,G2/M期细胞数从（34.79±3.80）%下降至（15.45±1.63）%。但抑制Chk2的表达并不影响EA6诱导的细胞G2/M期阻滞;另外抑制Chk1的表达后,EA6不再抑制CNE-1细胞的增殖。结果还显示,EA6作用CNE-1细胞后c-myc的转录水平明显低于对照组,而抑制Chk1的表达后可使c-myc的表达恢复至与对照组相当的水平。结论:本研究通过对蟛蜞菊进行逐级的分离与MTT实验相结合的方法,确定100%甲醇洗脱部位为蟛蜞菊抗肿瘤的有效部位（EA6）。进一步的研究发现,EA6主要通过引起Chk1介导的G2/M期阻滞而有效抑制CNE-1细胞增殖,Chk1可能是EA6发挥抗肿瘤活性的重要分子靶点。

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摘要

Abstract

第一章序言

1.1 研究背景

1.1.1 蟛蜞菊（Wedelia chinensis）化学成分的研究现状

1.1.2 蟛蜞菊（Wedelia chinensis）药理作用的研究现状

1.2 研究目的及意义

1.3 研究内容

1.3.1 蟛蜞菊水提物和醇提物抗肿瘤作用的研究

1.3.2 蟛蜞菊抗肿瘤有效部位的分离及筛选

1.3.3 蟛蜞菊抗肿瘤有效部位对肿瘤细胞凋亡及细胞周期的影响

1.3.4 蟛蜞菊抗肿瘤有效部位作用机制的研究

第二章蟛蜞菊水提物和醇提物抗肿瘤作用的研究

2.1 前言

2.2 实验材料

2.2.1 细胞株

2.2.2 主要试剂耗材

2.2.3 主要仪器设备

2.2.4 主要溶液配制

2.3 实验方法

2.3.1 药物的制备

2.3.2 细胞培养

2.3.3 蟛蜞菊水提物及醇提物抗肿瘤活性的体外筛选

2.3.4 统计分析

2.4 实验结果

2.4.1 蟛蜞菊醇提物和水提物抗肿瘤活性的体外筛选

2.4.2 蟛蜞菊 70%乙醇提取物对多种肿瘤细胞增殖的抑制作用—敏感肿瘤细胞的体外筛选

2.5 讨论

第三章蟛蜞菊抗肿瘤有效部位的分离及筛选

3.1 前言

3.2 实验材料

3.2.1 细胞株

3.2.2 主要试剂耗材

3.2.3 主要仪器设备

3.2.4 主要溶液配制

3.3 实验方法

3.3.1 药物制备

3.3.2 细胞培养

3.3.3 蟛蜞菊70%乙醇提取物各萃取相对CNE-1 细胞增殖抑制作用

3.3.4 硅胶柱层析分离乙酸乙酯萃取相

3.3.5 各次级部位对CNE-1 细胞增殖抑制作用

3.3.6 统计分析

3.4 实验结果

3.4.1 蟛蜞菊 70%乙醇提取物各萃取相对 CNE-1 细胞增殖抑制作用——抗肿瘤初级有效部位的体外筛选

3.4.2 蟛蜞菊 70%乙醇提取物各萃取相作用 48 h 后 CNE-1 细胞形态学观察

3.4.3 不同浓度乙酸乙酯萃取相作用 48 h 后 CNE-1 细胞形态学观察

3.4.4 硅胶柱层析分离乙酸乙酯萃取相后各次级部位对 CNE-1 细胞的抑制作用

3.4.5 蟛蜞菊抗肿瘤有效部位 EA6 对 CNE-1 细胞增殖的抑制作用

3.5 讨论

第四章蟛蜞菊抗肿瘤有效部位（EA6）对CNE-1 细胞凋亡及细胞周期的影响

4.1 前言

4.2 实验材料

4.2.1 细胞株

4.2.2 主要试剂耗材

4.2.3 主要仪器设备

4.2.4 主要溶液配制

4.3 实验方法

4.3.1 细胞培养

4.3.2 流式细胞术检测细胞周期

4.3.3 流式细胞术检测细胞凋亡

4.3.4 Hoechst 染色检测细胞凋亡

4.3.5 数据统计

4.4 实验结果

4.4.1 流式细胞术检测 EA6 对CNE-1 细胞周期的影响

4.4.2 流式细胞术检测 EA6 诱导CNE-1 细胞凋亡的作用

4.4.3 Hoechst 染色检测 EA6 诱导 CNE-1 细胞凋亡的作用

4.5 讨论

第五章 EA6 诱导细胞G2/M 期阻滞的分子机制研究

5.1 前言

5.2 实验材料

5.2.1 细胞株

5.2.2 主要试剂耗材

5.2.3 主要仪器设备

5.2.4 主要溶液配制

5.2.5 Real-time PCR 及 RT-PCR 引物

5.2.6 Chk1/Chk2 siRNA

5.3 实验方法

5.3.1 细胞培养

5.3.2 药物处理

5.3.3 siRNA转染

5.3.4 流式细胞术检测细胞周期

5.3.5.细胞总RNA提取

5.3.6 RT-PCR

5.3.7 Real-time PCR

5.3.8 PCR

5.3.9 数据统计

5.4 实验结果

5.4.1 si-Chk1和si-Chk2对Chk1和Chk2基因mRNA水平的影响

5.4.2 RNA干扰Chk1和Chk2表达对EA6诱导CNE-1细胞G2/M周期阻滞的影响

5.4.3 RNA干扰Chk1和Chk2表达对EA6抑制CNE-1细胞增殖的影响

5.4.4 RNA干扰Chk1和Chk2表达对cyclin D1、cyclin B1和c-myc 基因表达的影响

5.4.5 EA6 对不同肿瘤细胞中 c-myc 基因表达的影响

5.5 讨论

全文总结

研究展望

参考文献

附录1 英文缩写语中文对照

附录2 攻读学位期间科研情况

文献综述

参考文献

附图

致谢

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