红景天糖基转移酶家族基因克隆、鉴定及转基因发根系统的建立

论文摘要

红景天是景天科红景天属植物,其公认的有效成分为红景天苷,现代药理学研究表明,红景天苷具有提高免疫力、抗肿瘤、降血糖、耐缺氧、抗微波辐射、抗病毒、抗疲劳等功能,具有很高的经济价值和广阔的开发前景,现在红景天作为保健药物资源和食品资源已得到了国家的承认。但是,野生红景天植物资源日渐濒危,人工大面积栽培由于根腐病等原因还不成功,同时因为红景天中红景天苷含量极低,所以不但导致红景天苷售价极高（每克纯度为98%的产品价格为5000元左右）,而且还满足不了市场的需求。因此,利用现代生物技术如基因工程、酶工程、发酵工程技术大量制备红景天苷是一个有效降低其成本的办法。在红景天中合成红景天苷的最后一步反应是酪醇糖基化反应,催化这个反应的关键酶是UDP-葡萄糖基转移酶。所以提高这个关键酶表达量很有可能提高红景天苷的含量。本研究中应用CODEHOP简并引物设计方法结合RACE方法,同时在茉莉酮酸甲酯对植物材料进行诱导的情况下,在红景天中克隆得到了2个糖基转移酶基因,命名为UGTC2和UGTR,加上本实验室已经克隆的UGTC1三个基因分别通过大肠杆菌异源表达、鉴定,结果表明:三个酶对酪醇都具有催化活性,其中UGTR对酪醇的催化能力最强。然后构建了植物高效表达载体pCAUGTC1、pCAUGTC2和pCAUGTR并利用发根农杆菌ATCC15834介导分别建立了高山红景天转基因毛状根系统,结果表明,体内试验与体外试验的结论是一致的。经HPLC测定,利用UGTR转化得到的发根中红景天苷含量最高。综上,通过对红景天苷生物合成关键基因的分离、鉴定和比较研究,进一步建立了红景天的转基因发根系统,为利用生物反应器大规模工业化生产红景天苷奠定了基础。

论文目录

• 提要
• Summary
• 前言
• 第一篇 文献综述
• 第一章 红景天及红景天苷研究进展
• 1 红景天的化学成分及药理作用
• 1.1 红景天的化学成分
• 1.2 红景天的药理作用
• 2 红景天的有效成分提取制备
• 2.1 酪醇的提取与制备
• 2.2 红景天苷的提取与制备
• 3 红景天的生态学研究
• 4 红景天的生物学研究进展
• 4.1 组织培养及快速繁殖
• 4.2 悬浮细胞培养
• 4.3 发根培养
• 第二章 高等植物糖基转移酶的研究进展
• 1 糖基转移酶的分类
• 2 葡萄糖基转移酶的分析与鉴定
• 2.1 通过蛋白纯化方法鉴定
• 2.2 分子生物学方法鉴定
• 2.3 借助功能基因组学方法鉴定
• 3 酪醇糖基转移酶
• 第三章 毛状根生产次生代谢物的研究进展
• 1 毛状根的优良特性
• 1.1 激素自养
• 1.2 生长迅速
• 1.3 遗传稳定性
• 2 毛状根生产次生代谢产物的研究进展
• 3 展望
• 第二篇 研究内容
• 第一章 高山红景天糖基转移酶家族基因的分离及特性分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 红景天愈伤细胞与根中糖基转移酶活性随时间变化趋势
• 2.2 总RNA 的提取
• 2.3 UGTC2 和UGTR 基因3'端序列的分离
• 2.4 UGTC2 和UGTR 基因5'端序列的克隆
• 2.5 UGTC2 和UGTR 基因的电子合并及全长cDNA 的克隆
• 2.6 UGTC1 基因全长cDNA 的克隆
• 2.7 UGTC2 和UGTR 基因的生物信息学分析
• 2.8 UGTC2 和UGTR 基因的结构和功能域分析
• 2.9 UGTC2 和UGTR 与其它植物UDP-葡萄糖基转移酶氨基酸序列的多序列比对
• 2.10 UGTC1，UGTC2 和UGTR 与拟南芥和其它植物部分已鉴定葡萄糖基转移酶基因的系统进化树构建与分析
• 3 讨论
• 3.1 高山红景天糖基转移酶基因克隆方案的选择
• 3.2 引物设计方法的选择
• 4 小结
• 第二章 高山红景天糖基转移酶基因异源表达及其催化功能研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 重组载体pET-28a-UGTC1、pET-28a-UGTC2 和pET-28a-UGTR的鉴定
• 2.2 重组载体pET-28a-UGTC1、pET-28a-UGTC2 和pET-28a-UGTR的测序
• 2.3 UGTC1、UGTC2 和UGTR 基因在E.coli 中诱导表达的SDS-PAGE分析
• 2.4 纯化后的蛋白的SDS-PAGE 分析
• 2.5 蛋白浓度的测定
• 2.6 重组蛋白对酪醇催化性质的研究
• 3 讨论
• 4 小结
• 第三章 发根农杆菌介导的葡萄糖基转移酶转化高山红景天
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 pCAUGTC1、pCAUGTC2 和pCAUGTR 载体的构建
• 2.2 重组载体 pCAUGTC1、pCAUGTC2 和 pCAUGTR 载体的鉴定
• 2.3 转基因发根系统的建立
• 2.4 转基因发根的鉴定
• 2.5 高山红景天转基因发根红景天苷的HPLC 检测
• 3 讨论
• 3.1 转化系统的选择
• 3.2 转基因系统的构建
• 3.3 转基因发根检测
• 4. 小结
• 结论
• 参考文献
• 攻博期间发表的学术论文及其他成果
• 中文摘要
• Abstract
• 致谢
• 导师简介
• 作者简介