论文摘要
DNA条形编码是以线粒体细胞色素c氧化酶Ⅰ亚基（COⅠ）作为一个统一的目标基因进行DNA序列分析，以达到鉴定生物种的目的，是近年来引人注目的一种分子生物学分类方法。为了初步探讨DNA条形编码在鸡艾美耳球虫（Eimeria）中的应用，本研究在通过单卵囊分离感染、生物学鉴定及特异性引物PCR鉴定建立纯株的基础上，首次对鸡球虫不同种／株的COⅠ基因片段进行序列分析，并结合18S rRNA基因，对鸡球虫分子分类进行研究，为鸡球虫分类学开拓了新思路。为了保证研究所用虫种／株为单一虫种，本研究对实验室保存的堆型艾美耳球虫（E．acervulina）、柔嫩艾美耳球虫（E．tenella）、巨型艾美耳球虫（E．maxima）、变位艾美耳球虫（E．mivati）、毒害艾美耳球虫（E．necatrix）、布氏艾美耳球虫（E．brunette）共6种11株，进行了179个单卵囊分离，每个卵囊感染1只1～5日龄雏鸡，结果获得单卵囊分离物42个，单卵囊分离平均成功率为23.46％。对其中11个单卵囊分离物进行繁殖，按照传统生物学鉴定方法选取潜在期、寄生部位、最短孢子化时间、卵囊形状、卵囊大小及孢子囊大小等指标，对单卵囊分离物进行虫种鉴定，结果确定为E．acervulina 1株、E．tenella 2株、E．maxima 6株、E．mivati 1株、E．necatrix 1株。采用针对E．acervulina、E．tenella和E．maxima的种特异性引物，分别对传代增殖后的11株单卵囊分离株和2株实验室保存虫种进行PCR扩增，以验证生物学的鉴定结果和检测物的虫种纯度，结果仅在1株单卵囊分离物（E．maxima Townsends strain）的繁殖样品中检测出被E．tenella污染。为了初步探讨COⅠ基因作为鸡球虫DNA条形编码的可行性，本研究对经鉴定的10个单卵囊分离纯株和2个实验室保存株的COⅠ分别进行扩增，均得到811 bp的片段。多序列比对结果显示同种不同株间均无差异，同源性为100％；种间差异较大，其中E．tenella与E．necatrix的同源性最高，达98.4％，E．maxima与E．acervulina的同源性最低，为86.1％。分析5个种两两之间的遗传距离，其中E．maxima与E．necatrix的遗传距离最大，为0.171；E．tenella与E．necatrix的遗传距离最小，为0.017。分析5条序列组成，A+T平均含量为64.8％，明显高于G+C含量。进化树显示在5种球虫间，E．tenella和E．necatrix亲缘关系最近，二者形成一个独立的分枝，与E．acervulina、E．mivati和E．maxima共同聚为一大类，能与其他4个属的原虫明显区分开。为了进一步验证mtCOⅠ基因用于鸡球虫分类的准确性，本研究利用常用的18S rRNA基因进行系统进化分析。对3种球虫8个虫株的18S rRNA基因分别进行扩增，获得长度为1746～1756bp基因。经多序列比对，结果显示同种不同株间的同源性大于不同种间的同源性，其中3个E．maxima株间同源性在98.7％～99.3％之间，4个E．tenella株间同源性在99.7％～99.9％之间，三个不同的种间同源性为96.5％～98.1％。计算8个株两两之间的遗传距离，3个种中E．maxima与E．tenella的遗传距离最大，为0.038；E．maxima与E．acervulina的遗传距离最小，为0.021。3个E．maxima聚为一支，与E．brunetti、E．mitis、E．mivati、E．praecox和E．acervulina聚为一大分支，其中E．mitis和E．mivati亲缘关系最接近；4个E．tenella，与E．necatrix共同形成一个分支，说明E．tenella与E．necatrix的亲缘关系最近。结果与以mtCOⅠ基因构建的进化树结果一致。本研究说明mtCOⅠ基因比18S rRNA基因更适合作为种间鉴定的理想靶基因，有望成为寄生虫DNA条形编码的目的基因。