毕赤酵母表达风味强化肽呈味研究

论文摘要

牛肉风味肽（Beefy Meaty Peptide, BMP）最初是从牛肉的木瓜蛋白酶水解物中分离得到的一种八肽。经过分析证明BMP是牛肉风味的主要成分之一,与谷氨酸钠具有较好的协同呈味作用,可以增强牛肉的风味,并且具有良好的热稳定性,适合于食品工业生产的热处理要求。本论文应用毕赤酵母发酵表达不同拷贝牛肉风味肽（4BMP、8BMP、12BMP、16BMP）,分别以牛肉汤和不含风味肽（BMP）的发酵液作对照,经过美拉德热反应制备牛肉香精。对不同拷贝数的BMP制备的牛肉香精产品风味特性进行感官评价。通过单因素实验优化美拉德反应各组分及反应条件,并确定其反应的最佳工艺,筛选出一种产牛肉香味浓郁的牛肉香精生产工艺条件,最后对产品香气成分进行鉴定分析,得到香精产品中系列风味物质。首先在发酵罐培养控制研究基础上,对重组毕赤酵母GS115（pPIC9-16BMP）、 GS115（pPIC9-12BMP）、GS115（pPIC9-8BMP）、GS115（pPIC9-4BMP）、GS115（pPIC9）这五种工程菌分别采用三步发酵法的策略诱导表达BMP,即甘油分批培养阶段、甘油补料分批培养阶段和甲醇补料培养阶段。以15mL/L-h的速度流加甘油4h；甲醇的流加基于溶氧控制,采用限制性流加甲醇策略,通过调节补料周期和脉冲,使甲醇的流加速率约等于消耗速率,从而将溶氧控制在10%～25%之间。不同拷贝数BMP发酵液采用中空纤维超滤及真空旋转蒸发对目标蛋白进行浓缩,进一步进行SDS-PAGE分析,通过蛋白分析软件Quantity One分析SDS-PAGE电泳图中目标蛋白占整条带中蛋白的比例,通过考马斯亮蓝法测出总蛋白浓度,计算目标蛋白含量。等体积不同拷贝数BMP含量比例分别为：16BMP:12BMP:8BMP:4BMP=36.42:24.74:21.32:17.52。呈味实验表明：不含BMP的发酵液制备的牛肉香精牛肉特征味不明显,总体肉香味弱；以牛肉汤为基料制备的牛肉香精牛肉特征味明显,但强度弱；以含多拷贝BMP发酵液制备的牛肉香精肉香味和牛肉特征味明显。其中8BMP、12BMP、16BMP牛肉特征突出,肉香味明显,且权重评分方差分析显示三种多肽制备的牛肉香精总体风味无显著性差异,但4BMP制备的牛肉香精风味较差,焦糊味重。在美拉德呈味反应研究中,以16BMP的超滤浓缩液为反应基料,通过单因素实验和感官评价实验确定了最佳的呈味反应配方为：牛肉风味肽超滤浓缩液50.00%（V/V）,水50.00%（V/V）,木糖10.00%（M/V）,1.00%半胱氨酸（M/V）,1.0%硫胺素（M/V）,2.00%牛脂（M/V）,3.75%牛磺酸（M/V）,0.70%复合氨基酸（M/V）,5.00%的水解植物蛋白粉（HVP）（M/V）,2.00%NaCl（M/V）。通过正交试验确定美拉德反应条件为：反应时间为90min,反应温度为100℃,反应起始pH为5.0。此时制备的香精牛肉香气特征突出,口感醇厚,肉质感强,留香时间长。最后,利用顶空固相微萃取法（HS-SPME）,通过气相色谱与质谱联用仪（GC-MS）对煮牛肉汤和美拉德反应产物的挥发性风味成分进行了检测。从煮牛肉汤中共鉴定出15种挥发性成分,在美拉德反应产物共鉴定出33种挥发性成分。其中有13种化合物与煮牛肉汤挥发性化合物的鉴定结果完全相同。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 生物活性肽概述
• 1.1.1 食品感官肽的分类
• 1.1.2 生物活性肽的来源与制备
• 1.2 牛肉风味肽
• 1.2.1 牛肉风味肽概述
• 1.2.2 牛肉风味肽的结构与风味
• 1.2.3 牛肉风味肽的研究进展
• 1.3 斯德毕赤酵母表达系统
• 1.3.1 毕赤酵母的生物学特点
• 1.3.2 毕赤酵母表达系统的优点
• 1.3.3 毕赤酵母发酵生产外源蛋白的过程
• 1.3.4 表达蛋白纯化方法
• 1.4 肉香味的形成机理
• 1.4.1 形成肉香味的前体物
• 1.4.2 形成肉香味的途径
• 1.5 美拉德反应
• 1.5.1 美拉德反应的机理
• 1.5.2 美拉德反应的影响因素
• 1.5.3 美拉德反应中的肉味化合物
• 1.5.4 美拉德反应肉昧香精中的应用
• 1.6 香气成分的感官分析
• 1.6.1 分析型感官评价
• 1.6.2 偏爱型感官评价
• 1.7 肉味香精挥发性风味成分分析
• 1.8 本课题的研究意义和研究内容
• 1.8.1 本课题的研究目的
• 1.8.2 本课题的研究意义
• 1.8.3 本课题的主要内容
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 主要实验菌种
• 2.1.2 主要实验试剂
• 2.1.3 实验仪器
• 2.1.4 培养基
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 菌种活化
• 2.2.2 种子液制备
• 2.2.3 发酵罐（5L）发酵表达不同拷贝数的BMP
• 2.2.4 发酵液预处理
• 2.2.5 生物量的测定
• 2.2.6 蛋白浓度的测定
• 2.2.7 目标蛋白BMP含量的测定
• 2.2.8 SDS—PAGE蛋白电泳方法
• 2.3 美拉德呈味试验
• 2.3.1 牛肉汤的制备
• 2.3.2 美拉德呈味反应
• 2.3.3 美拉德反应程度的测定
• 2.4 感官评定与统计分析
• 2.4.1 简单描述法
• 2.4.2 评分检验法
• 2.4.3 排序检验法
• 2.4.4 SPSS软件进行方差分析评价结果有效性
• 2.5 挥发性风味物质的测定
• 2.5.1 SPME法提取样品中挥发性风味物质
• 2.5.2 GC-MS联用对挥发性风味的鉴定
• 3 结果与讨论
• 3.1 总蛋白标准曲线的测定
• 3.2 不同拷贝风味肽（4BMP、8BMP、12BMP、16BMP）表达结果分析
• 3.2.1 16BMP表达结果
• 3.2.2 12BMP表达结果
• 3.2.3 8BMP表达结果
• 3.2.4 4BMP表达结果
• 3.2.5 不同拷贝数BMP发酵浓缩液总蛋白浓度
• 3.2.6 GS115（pPIC9）发酵浓缩液的制备
• 3.3 不同拷贝数风味肽进行SDS-PAGE电泳结果分析
• 3.4 不同拷贝数浓缩液进行美拉德呈味反应分析
• 3.5 美拉德反应牛肉风味香精感官评价
• 3.5.1 应用SPSS软件进行方差分析评价结果有效性
• 3.5.2 简单描述法评价不同样品间风味差异性
• 3.5.3 方差分析四种BMP风味差异性
• 3.6 美拉德热反应单因素实验结果与分析
• 3.6.1 单因素实验确定美拉德反应组分含量
• 3.6.2 单因素实验确定热反应条件
• 3.7 美拉德热反应条件的优化实验
• 3.8 牛肉香精中挥发性风味成分分析
• 3.8.1 顶空固相微萃取提取挥发性风味物质
• 3.8.2 挥发性化合物的鉴定
• 3.8.3 16BMP制备牛肉香精工艺条件及鉴定结果
• 4 结论
• 5 展望
• 6 参考文献
• 7 攻读硕士研究生学位期间发表论文情况
• 8 致谢
• 附录