猪粪堆肥中微生物变化规律及芽孢杆菌分离与鉴定

论文摘要

随着集约化畜牧业迅猛的发展,大量的畜禽粪便造成了环境污染,并成为限制畜牧业持续发展的重要因素。畜禽粪便中含有丰富的肥源,如果用科学的方法对其处理,不仅可以控制污染,保护环境,还可以变废为宝。好氧堆肥工艺具有经济,简便,不需要外加能源,无二次污染等特点,是目前处理粪便的主要方式之一。本次试验在华中农业大学猪场,采用新鲜猪粪掺以辅料,锯末和米糠,按照条剁式自然堆肥系统自然堆肥。堆肥过程是由相关微生物群体进行的生物转化过程。本试验通过变性梯度凝胶电泳(DGGE),传统富集培养和平板计数法对堆肥化过程中微生物的区系动态变化进行了研究。堆肥结果表明,在堆肥化过程中,微生物数量总的趋势是细菌的数量最多,放线菌次之,真菌的数量最少。真菌包括霉菌和酵母菌。升温期微生物的数量始终高于高温微生物。当堆肥发酵结束后,降温期微生物的数量低于发酵初始水平,高温放线菌和高温真菌的数量试验结束后低于初始水平,高温细菌的数量在整个堆肥化过程中变化不大。通过DGGE分析表明:发酵过程中细菌的种类发生了明显的更迭现象。堆肥初期主要以芽孢杆菌属,梭菌属,解脲芽孢杆菌属等细菌占优势;中期梭菌属,芽孢杆菌属,假单孢菌属等细菌占优势;后期梭菌属,假单孢菌属等占优势;而在整个堆肥化过程中芽孢杆菌属,梭菌属,和假单孢属的微生物都是优势菌群。而堆肥辅料的不同,并不明显影响其中微生物的变化规律。不论是从堆肥的物理性状还是化学指标来看,堆体0～30天都快速经过了完整的常规堆肥一次发酵过程。DGGE检测表明这个过程中细菌的微生物群落发生了很大的变化。堆体内细菌群类在堆肥期中总体呈振荡下降,递减趋势。对堆肥中的优势菌群芽孢杆菌进行了相关的研究,包括芽孢杆菌的分离,计数,初步生理生化鉴定和16S rRNA的核酸菌种鉴定。16S rRNA目前是进行微生物菌种鉴定的主要方法和手段之一,它主要是以原核生物的核糖体小亚基上的16S rRNA中所包含的遗传信息来进行分类和鉴定。在堆体中分离的7株芽孢杆菌中,通过形态特征,培养特性和生理生化指标,以及对淀粉,蛋白质,纤维素和油脂等物质的水解试验,从中筛选出了4株活力较强的菌株。16S rRNA鉴定表明它们分别是:苏云金芽孢杆菌,蜡样芽孢杆菌,巨大芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。这四株菌不但属于堆肥发酵周期中的优势菌群,而且初步探讨其功能,表现良好。它们有望制成微生物制剂,为缩短堆肥周期,提高堆肥质量发挥着作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 我国畜牧业排放粪污对环境污染现状
• 1.1.1 我国畜牧业粪污排放的恶劣程度
• 1.1.2 粪污对大气的污染
• 1.1.3 粪污对水体的污染
• 1.1.4 粪污放对土壤的污染
• 1.2 堆肥技术处理畜牧业粪污的方法和原理
• 1.2.1 畜禽粪污的特点
• 1.2.2 堆肥技术概念
• 1.2.3 畜禽粪污好氧堆肥的技术原理
• 1.2.4 堆肥中的微生物过程
• 1.2.5 研究堆肥微生物的分子生物学技术
• 1.2.6 DGGE的原理
• 1.3 芽孢杆菌的研究进展
• 1.3.1 芽孢杆菌属
• 1.3.2 16S rRNA方法鉴定菌种的原理与应用
• 第二章 研究目的和意义
• 第三章 材料和方法
• 3.1 试验材料
• 3.1.1 主要试剂及药品
• 3.1.2 缓冲液和常用试剂的配置
• 3.1.3 主要培养基
• 3.1.4 主要设备仪器
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 条剁式自然堆肥系统
• 3.2.2 堆肥指标的测定
• 3.2.3 堆肥不同温期样品的采集
• 3.2.4 样品中微生物的分离和计数
• 3.2.5 样品中微生物总DNA的提取和纯化
• 3.2.5.1 粗提DNA
• 3.2.5.2 DNA的纯化
• 3.2.6 基因组DNA检测
• 3.2.6.1 基因组DNA质量浓度检测
• 3.2.6.2 基因组DNA的琼脂糖凝胶检测
• 3.2.7 细菌V3区PCR扩增和琼脂糖检测
• 3.2.8 DGGE凝胶电泳
• 3.2.8.1 制作水平变性胶
• 3.2.8.2 DGGE电泳
• 3.2.8.3 DGGE染色
• 3.2.8.4 凝胶成像
• 3.2.9 DGGE分析
• 3.2.9.1 Quantity One软件包分析
• 3.2.9.2 显著条带回收测序分析
• 3.2.10 芽孢杆菌的分离和纯化培养
• 3.2.11 芽孢杆菌的16S rRNA鉴定
• 3.2.11.1 芽孢杆菌染色体DNA的提取和纯化
• 3.2.11.2 PCR扩增和琼脂糖电泳
• 3.2.12 芽孢杆菌的传统鉴定
• 3.2.12.1 芽孢杆菌的形态观察
• 3.2.12.2 芽孢杆菌的芽孢观察
• 3.2.12.3 芽孢杆菌的生理生化鉴定
• 3.2.13 芽孢杆菌的功能检测
• 第四章 试验结果
• 4.1 堆肥结果和指标的测定值
• 4.1.1 堆体的表观形态
• 4.1.2 堆体的温度变化
• 4.1.3 堆体的pH值变化
• 4.1.4 堆体的C/N值变化
• 4.1.5 堆体的其它元素变化
• 4.2 微生物的传统培养
• 4.3 微生物基因组DNA
• 4.3.1 基因组DNA含量浓度检测
• 4.3.2 基因组DNA的琼脂糖检测
• 4.4 DGGE分析堆肥微生物变化规律
• 4.4.1 细菌V3区扩增片段
• 4.4.2 细菌V3区DGGE电泳图
• 4.4.3 软件分析DGGE图谱
• 4.4.4 割胶回收条带测序分析
• 4.5 芽孢杆菌的分离和鉴定
• 4.5.1 芽孢杆菌的分离
• 4.5.2 芽孢杆菌的鉴定
• 4.5.2.1 菌落形态鉴定
• 4.5.2.2 生理生化鉴定
• 4.5.2.3 细菌16S rRNA鉴定
• 4.5.2.4 菌株功能的初步探讨
• 第五章 讨论与分析
• 5.1 不同因素对堆肥微生物的影响
• 5.1.1 温度的影响
• 5.1.2 C/N值的影响
• 5.1.3 含水率的影响
• 5.1.4 pH值的影响
• 5.2 堆肥中总DNA的提取
• 5.3 堆肥微生物的变化规律
• 5.4 芽孢杆菌的分离和鉴定
• 5.5 芽孢杆菌的功能探讨
• 第六章 小结
• 6.1 本研究所取得的成果及创新
• 6.2 下一步值得研究的工作
• 参考文献
• 附录 （获得的芽孢杆菌16S RRNA基因序列）
• 致谢