羊附红细胞体双抗体夹心ELISA诊断方法的建立

论文摘要

羊附红细胞体病是一种人畜共患病,其病原体为羊附红细胞体（E.ovis）。为了准确快速诊断该病,为及时进行有效防治提供技术支撑,本试验探索一种准确高效的羊附红细胞体特异性抗原制备技术,以此建立特异、灵敏的双抗体夹心ELISA检测方法。采集红细胞感染率>90%的羊附红细胞体阳性抗凝血,分别应用水浴法和药物体外驱虫法对羊附红细胞体进行解离,观察分离前后附红细胞体感染率（%）、红细胞感染强度（个）、附红细胞体数（1×104/mm3）、杂质含量和附红细胞体的运动性五项指标；提取附红细胞体抗原,制备全蛋白悬液,测定蛋白质含量,比较解离效果。将两种方法制备的羊附红细胞体抗原全蛋白进行SDS-PAGE试验,观察条带是否一致。结果显示,200mL血液中加入1mL双向红链灭,4℃作用36h,即可达到较好分离效果。与水浴法相比,解离后,红细胞感染率和感染强度明显下降,蛋白含量增加,收率高,纯度好。SDS-PAGE结果显示,体外驱虫法所制备的附红细胞体抗原全蛋白悬液,其抗原蛋白带与水浴法相同。应用体外驱虫法粗制羊附红细胞体抗原全蛋白,采用切胶技术、水平电泳技术和透析方法将其纯化后,再应用SDS-PAGE和免疫印迹试验筛选出有免疫原性的特异性抗原蛋白成分。再次纯化这些成分,并免疫家兔,制备并提纯抗体,进一步建立特异、灵敏的血清学检测方法—双抗体夹心ELISA方法。结果表明,粗制抗原主要由4条带组成,纯化后经分析分子量分别为115.35kDa,74.13 kDa,68.87 kDa,32.96 kDa。免疫印迹试验中,只分子量为115.35kDa和68.87 kDa的两条带与阳性血清反应,因此认定为羊附红细胞体特异性抗原蛋白。其余两条带或只一部分成阳性,或不反应。双抗体夹心ELISA试验结果表明,特异性免疫抗原蛋白浓度为1.8mg/mL,免疫家兔35天后,兔血清抗体效价高达1：5120；敏感性试验结果显示抗原最低检出量为3.55μg/mL,较应用粗制抗原制备抗体建立的ELISA方法敏感度提高。特异性试验结果显示,纯化抗体只与羊附红细胞体反应,而与肺炎支原体、大肠杆菌、葡萄球菌不反应；由交叉性试验结果可见,用纯化抗体检测抗原时,只有羊附红细胞体呈阳性反应,不与其他动物附红细胞体的抗原反应,说明本试验特异性好。从张家口地区某些羊场采取血样100份,应用本检测方法进行检测,结果羊附红细胞体阳性率为79%,优于镜检法（阳性率为62%）,差异显著（P<0.05）。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 课题提出的背景及研究意义
• 1.1.1 课题提出的背景
• 1.1.2 课题的研究意义
• 1.2 国内外研究现状
• 1.2.1 国内外研究现状
• 1.2.2 目前存在的问题
• 1.3 主要研究内容、方法及思路
• 1.3.1 应用药物体外驱虫法粗制羊附红细胞体抗原
• 1.3.2 羊附红细胞体特异性抗原制备
• 1.3.3 双抗体夹心ELISA检测方法的建立及应用
• 1.4 SDS-PAGE的原理及特点
• 1.5 免疫印迹技术原理及特点
• 第二章 材料、方法与程序
• 2.1 材料与仪器
• 2.1.1 试验动物
• 2.1.2 主要生物学试剂
• 2.1.3 主要化学试剂
• 2.1.4 主要仪器
• 2.2 方法与程序
• 2.2.1 主要溶液的配制
• 2.2.2 粗制羊附红细胞体抗原
• 2.2.3 羊附红细胞体抗原全蛋白的SDS-PAGE
• 2.2.4 羊附红细胞体特异性抗原制备
• 2.2.5 羊附红细胞体双抗体夹心ELISA检测方法的建立
• 第三章 结果
• 3.1 羊附红细胞体形态学观察结果
• 3.2 应用体外驱虫法粗制羊附红细胞体抗原结果
• 3.2.1 附红细胞体分离前后镜检结果
• 3.2.2 解离液蛋白浓度测定
• 3.2.3 抗原全蛋白的SDS-PAGE试验
• 3.3 羊附红细胞体特异性抗原制备结果
• 3.3.1 兔抗羊附红细胞体阳性血清效价测定结果
• 3.3.2 粗制抗原全蛋白的SDS-PAGE试验结果
• 3.3.3 纯化抗原蛋白SDS-PAGE分析结果
• 3.3.4 免疫印迹试验筛选特异性抗原蛋白结果
• 3.4 羊附红细胞体双抗体夹心ELISA检测方法的建立
• 3.4.1 兔抗羊附红细胞体阳性血清效价测定结果
• 3.4.2 纯化抗体含量测定结果
• 3.4.3 羊附红细胞体双抗体夹心ELISA试验条件选择结果
• 第四章 讨论
• 4.1 羊附红细胞体显微镜检查
• 4.2 羊附红细胞体解离技术探讨
• 4.3 羊附红细胞体特异性抗原制备技术探讨
• 4.4 双抗体夹心ELISA诊断方法的建立
• 第五章 全文结论
• 5.1 探索出一种羊附红细胞体解离新技术
• 5.2 新建一种羊附红细胞体特异性抗原制备技术
• 5.3 建立了羊附红细胞体双抗体夹心ELISA检测方法
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历