阿特拉津脱氯水解酶（TrzN）的定向进化

论文摘要

TrzN是一种新的阿特拉津脱氯水解酶,它与AtzA具有相同的作用,但具有更广泛的底物谱。然而,TrzN在表达菌株中诱导表达时,容易形成不具有活力的包涵体。本实验旨在通过定向进化的方法,提高TrzN的可溶性表达及其酶活性。定向进化的两个关键性步骤是建立分子的多样性文库和高通量筛选体系。本实验采用Error-Prone PCR来建立分子的多样性,以pRBB作为载体建立突变体文库。根据TrzN水解阿特拉津产生羟基阿特拉津在平板上能产生水解圈的特性建立了高通量的筛选体系。突变菌株在37℃下过夜培养,筛选水解圈/菌落克隆直径大于野生型菌的克隆,作为研究对象进行发酵液上清和纯酶水平上的进一步鉴定。最终我们筛选到一株酶活性提高2.5倍且可溶性表达提高的突变株,命名为MuA-55,测序结果表明,MuA-55有三处碱基替换,其中一处（G568A）引起Gly190Ser,另外两处的无义突变使得密码子使用频率由低变高,甘氨酸与丝氨酸结构性状十分相似,丝氨酸在侧链上比甘氨酸多一个羟基,这使得蛋白的亲水性增强,有助于可溶性的表达。我们还得到一株名为MuE-118,其有5处碱基替换,其中一处与MuA-55相同（G568A）,也引起Gly190Ser,其余四处为无义突变,但是密码子使用频率的改变没有规律性可寻,其酶活性没有提高,反而降低了。为了解释MuA-55与MuE-118出现的性状差异现象,我们对两者进行了回复突变、定点突变和饱和突变,结果显示,两者性状差异现象产生的原因既有氨基酸突变的因素也有密码子使用频率改变的因素。我们还对突变文库中一株不具活性的突变株MuF-212进行了回复突变,发现第126位氨基酸的变化对酶活性的丧失具有决定性的作用,该位点位于活性中心附近。为了进一步解释MuA-55与MuE-118出现的性状差异现象,我们对MuA-55、MuE-118、TrzN（wild）进行了酶学性质的初步比较,结果显示,它们的最适pH值均为7.0,最适温度均为42℃。我们通过比较三者的最适pH范围,发现190位氨基酸的变化使酶的pH适应范围变大了。金属离子对酶活性的影响实验显示,Zn2+、Co2+对酶活有较大的促进作用,Cr2+、Ni2+对酶活有抑制作用,Li+、Mg2+、K+对酶活性没有明显的影响。综上所述,采用定向进化的方法,我们得到了一株酶活性提高2.5倍且可溶性表达提高的突变菌株MuA-55,并使其pH适应范围也有所变广

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号与缩略语说明
• 前言
• 第一章 文献综述
• 1 阿特拉津的结构及理化性质
• 2 除草剂阿特拉津的施用现状
• 3 阿特拉津对环境的影响
• 4 急性毒性和遗传毒性
• 5 阿特拉津的生物降解
• 6 阿特拉津脱氯水解酶（TrzN）
• 7 定向进化
• 7.1 体外定向进化的一般过程和要求
• 7.2 酶定向进化的策略
• 7.3 构建突变体文库的方法
• 7.4 定点突变,饱和突变
• 7.5 PCR介导的定点及饱和突变
• 8 影响大肠杆菌中外源基因表达的因素
• 8.1 表达载体的选择
• 8.2 外源基因中密码子的使用
• 8.3 mRNA的一级和二级结构的作用
• 8.4 mRNA稳定性的影响
• 8.5 宿主的选择
• 9 mRNA的序列、结构以及翻译速率与蛋白质结构的关系
• 参考文献
• 第二章 突变文库的构建及其方法的选择
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株与质粒
• 1.2 培养基
• 1.3 抗生素及使用浓度
• 1.4 试剂和酶
• 1.5 分子生物学操作
• 2 突变文库构建三种方法的比较分析
• 2.1 方法一 T7启动子带动trzN的表达,转化E.coli BL21（DE3）
• 2.2 方法二 LacZ启动子带动trzN的表达,转化E.coli DH5α
• 2.3 方法三 利用pRBB表达载体构建突变文库,转化E.coli DH10B
• 2.4 pRBB-trzN（wild）（DH10B）的构建
• 3 结果与分析
• 3.1 易错PCR条件的摸索
• 3.2 自配易错PCR buffer与常规PCR buffer扩增比较
• 3.3 LacZ promoter+trzN的扩增
• 3.4 pRBB-trzN（Mus）载体的构建
• 3.5 pRBB-trzN（wild）（DH10B）的构建
• 4 实验中文库构建三种方法的比较
• 5 本章小节
• 参考文献
• 第三章 突变文库的筛选及相关突变位点的研究
• 第一节 突变文库的筛选
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株与质粒
• 1.2 抗生素及使用浓度
• 1.3 试剂和酶
• 1.4 突变文库的筛选
• 2 结果与分析
• 2.1 几株突变株碱基及氨基酸变化
• 2.2 几株突变株碱基及氨基酸变化
• 3 本节小结
• 第二节 突变体基因的重组表达及相关突变位点的研究
• 1. 材料与方法
• 1.1 菌株与质粒
• 1.2 培养基
• 1.3 抗生素及使用浓度
• 1.4 试剂和酶
• 1.5 突变体基因（MuA-32、MuB-12、MuD-46、MuF-212）的重组表达
• 1.6 对MuF-212进行回复突变
• 1.7 MuA-55、MuE-118的回复、定点及饱和突变
• 1.8 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析
• 1.9 突变体的比酶活力测定分析
• 2. 结果与分析
• 2.1 突变体（MuA-32、MuB-12、MuD-46、MuF-212）的表达载体的构建
• 2.2 MuF-212第377位和第1160位碱基的回复突变
• 2.3 MuA-55第568位点的回复及trzN（wild）定点突变
• 2.4 MuE-118第568位点的回复突变
• 2.5 蛋白的诱导表达
• 2.6 突变体比酶活力的测定
• 2.7 MuA-55第568位点的饱和突变
• 3 本章总结
• 参考文献
• 第四章 MuA-55、MuE-118、TrzN（wild）酶学性质的初步研究
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 培养条件
• 1.3 温度和pH值对MuA-55、MuE-118、TrzN（wild）活性及稳定性的影响
• 1.4 金属离子对MuA-55活性的影响
• 2 结果与分析
• 2.1 pH值对MuA-55、MuE-118、TrzN（wild）活性的影响
• 2.2 温度对MuA-55、MuE-118、TrzN（wild）活性的影响
• 2.3 MuA-55、MuE-118、TrzN（wild）的pH稳定性测定
• 2.4 MuA-55、MuE-118、TrzN（wild）的热稳定性测定
• 2.5 金属离子对MuA-55活性的影响
• 3 本章总结
• 全文总结与展望
• 主要创新点
• 附录一 文中多用培养基、试剂及相关缓冲液配方
• 一 培养基
• 二 试剂
• 附录二 文中三种文库构建方法的载体构建图
• 致谢