小鼠精子核内转染技术的建立及其机理的研究

论文摘要

转基因动物的制作方法有五大类,十几种方案,但是长久以来一直不甚理想,目前仍然以显微注射法为主。由于显微注射法劳动强度大、效率低、周期长、耗费多,科学界一直在寻找替代方案。精子载体法就是以精子为载体,利用精子与卵子结合的过程将外源基因带入受精卵中形成转基因动物的方法,由于方法学上的简捷、便利、又适合几乎所有物种,从1989年Lavitrano用该法建立转基因小鼠以来,备受关注。经过十几年的发展,理论上已经逐渐阐明了精子载体法建立转基因动物的原因和特点,实践上方案有近十种之多。但是除了1999年Perry使用的胞浆内单精子注射的方法,其余方案稳定性、可重复性及转基因动物的形成效率依然不甚理想。我们总结了精子载体法发展的规律,指出核内转染是精子载体法发展的方向。围绕这一方向,我们在缺少同行工作借鉴的情况下,自己探索小鼠精子的核内转染技术。我们的实验设计主要建立在目前针对原代细胞和难转染细胞最常用的两种方法上,一种是方波分组电穿孔技术;一种是阳离子多聚物聚乙烯亚胺(Polyethylenimine,PEI)转染技术。通过三个串联的实验:(1) 小鼠精子的电穿孔液的研究,(2) 小鼠精子电穿孔条件的研究;(3) 阳离子多聚物PEI结合电穿孔实现小鼠精子的核内转染的研究;我们实现了小鼠精子的核内转染,解决了精子载体法建立转基因动物的关键问题,为以后进行大动物精子载体法的研究提供一个新的模式。 各部分实验摘要介绍如下:

论文目录

• 缩略词表
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 小鼠精子电转缓冲液的研究
• 1.1 摘要
• 1.2 引言
• 1.3 材料与方法
• 1.3.1 动物
• 1.3.2 主要试剂
• 1.3.3 仪器
• 1.3.4 方法与步骤
• 1.4 结果
• 1.4.1 精子在D-PBS+AA（对照组）中的形态
• 1.4.2 精子在实验组（低钠、高钾、等渗）电转缓冲液中的形态
• +、K⁺和葡萄糖的配比情况的观察'>1.4.3 不同Na⁺、K⁺和葡萄糖的配比情况的观察
• 1.4.4 镁离子浓度对精子样品的影响
• 1.4.5 果糖、甘露醇、蔗糖替换葡萄糖维持渗透压对精子的影响
• 1.4.6 引入1％浓度的甘油后对精子的影响
• 1.4.7 最终确定适合于精子的电转缓冲液
• 1.5 讨论
• 1.6 参考文献
• 第二章 小鼠精子电穿孔条件的研究
• 2.1 摘要
• 2.2 引言
• 2.3 材料与方法
• 2.3.1 动物
• 2.3.2 主要试剂
• 2.3.3 仪器
• 2.3.4 方法与步骤
• 2.4 结果
• 2.4.1 优化第一个脉冲电压
• 2.4.2 优化第一个脉冲脉宽
• 2.4.3 碘化丙啶标准的制作
• 2.4.4 用碘化丙啶电穿孔半定量分析，优化头两个脉冲的电压和脉宽组合
• 2.4.5 用碘化丙啶电穿孔半定量分析，优化头两个脉冲的间隔
• 2.4.6 优化促进物质转运的低压组的脉宽
• TM Fluorescent Oligo为大分子模型检测最终电穿孔方案的效果'>2.4.7 用荧光素标记的寡核苷酸探针BLOCK-iT^TM Fluorescent Oligo为大分子模型检测最终电穿孔方案的效果
• 2.4.8 最终电穿孔方案
• 2.5 讨论
• 2.6 参考文献
• 第三章 小鼠阳离子多聚物PEI结合电穿孔实现小鼠精子的核内转染的研究
• 3.1 摘要
• 3.2 引言
• 3.3 材料与方法
• 3.3.1 动物
• 3.3.2 主要试剂
• 3.3.3 仪器
• 3.3.4 方法与步骤
• 3.4 结果
• 3.4.1 JetPEI-FluoF精子毒性的观察
• 3.4.2 JetPEI-FluoF转染后样品的观察分析
• 3.4.3 JetPEI-FluoF／DNA复合物的电穿孔后样品的观察分析
• 3.5 讨论
• 3.6 参考文献
• 全文小结
• 附录一：综述
• 攻读学位期间成果
• 致谢
• 原创性声明及版权使用授权说明