棉铃虫功能基因重组病毒杀虫剂研究及棉铃虫细胞系的建立

论文摘要

棉铃虫是鳞翅目夜蛾科昆虫，因摄食杂，食量大，繁殖力强，严重危害我国农业经济。用化学药物控制害虫，害虫会逐渐产生抗药性，给防治带来更大的困难，同时化学药物也给人类健康带来不利。通过体内、体外研究方法，深入掌握害虫发育规律及机理，从生物学角度设计扰乱害虫生长或借用天然病原体控制害虫的生物防治具有针对性强，特异性高，对人类及环境无污染等优点，具有广阔的发展前景。 本论文在实验室前期工作基础上，进行了两种棉铃虫功能基因重组病毒杀虫剂的实验研究，为筛选新的重组病毒候选基因提供实验证据。论文还探索建立了三种体外连续传代的棉铃虫细胞系，为进一步在体外研究棉铃虫活体细胞的激素调控、病毒感染、细胞凋亡等分子生物学机制奠定了基础。现将论文内容概括如下： 第一部分：棉铃虫功能基因重组病毒杀虫剂研究 杆状病毒中绝大部分是昆虫特异性病原，因不感染脊椎动物，是理想的控制害虫的生物“工具”。然而根据研究得知，野生型杆状病毒具有杀虫谱窄，杀虫速度慢的缺点。遗传改造病毒，选用外源基因构建重组病毒，使重组病毒感染虫体后除了病毒的毒杀作用外还通过外源基因的持续表达双重干扰昆虫，以加快害虫的死亡、提高害虫的死亡率，大大减少农林业的经济损失。已报道了多种基因重组病毒，如蝎毒素、螨毒素、利尿激素、保幼激素酯酶等基因的重组病毒，其杀虫效果虽都优于相应的野生型病毒，但仍不理想。新的安全高效的基因重组病毒候选基因需要探索和发现。 棉铃虫激素接受子3（Helicoverpa hormone receptor 3，HHR3）是蜕皮激素直接诱导的棉铃虫蜕皮调节转录因子激素接受子3，是棉铃虫蜕皮级联反应过程的关键调控因子，HCB（Helicoverpa armigera cathepsin B-like proteinase）是参与棉铃虫胚胎发育及成虫脂肪体降解的半胱氨酸蛋白酶。实验室前期工作已将两个基因分别定点插入双启动子表达载体pFastBacDUAL（即p10启动子和多角体蛋白基因启动子，其中p10启动子下游已插入了绿色荧光蛋白基因）的多角体蛋白基因启动子下游，本论文在紧接侯选基因后面再插入来自AcMNPV的多角体基因，转座获得阳性重组菌株后，分别

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 第一部分 棉铃虫功能基因重组病毒杀虫剂研究
• 第一章 综述:昆虫杆状病毒研究进展
• 1 杆状病毒的类型存在形式、结构及感染宿主后的传播过程
• 2 杆状病毒表达系统的研究
• 3 重组杆状病毒生物杀虫剂
• 第二章 棉铃虫激素接受子3基因重组病毒杀虫剂研究
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 实验用品、仪器
• 2.1.2 昆虫和病毒
• 2.1.3 试剂
• 2.2 方法
• +的构建'>2.2.1 重组表达载体Bacmid-GFP-HHR3-Polh⁺的构建
• +转染Sf21细胞'>2.2.2 Bacmid-GFP-HHR3-Polh⁺转染Sf21细胞
• 2.2.3 重组病毒感染体外培养的Sf21细胞
• 2.2.4 重组病毒在Sf21细胞中的外源基因表达检测
• +感染棉铃虫幼虫'>2.2.5 重组病毒AcMNPV-GFP-HHR3-Polh⁺感染棉铃虫幼虫
• 2.2.6 重组病毒感染棉铃虫幼虫后外源基因的表达检测
• +杀虫生物活性检测'>2.2.7 重组病毒AcMNPV-GFP-HHR3-Polh⁺杀虫生物活性检测
• 3 结果
• 3.1 重组表达载体构建和验证
• 3.2 重组病毒感染Sf21细胞后外源基因的重组表达
• 3.3 重组病毒感染棉铃虫幼虫后外源基因的重组表达
• 3.4 重组病毒杀虫效果
• 4 讨论
• 第三章 棉铃虫组织蛋白酶B（HCB）基因重组病毒杀虫剂研究
• 前言
• 第一节 HCB在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中的试表达
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 重组表达载体转染Sf21细胞
• 2.2 转染上清液感染Sf21细胞
• 2.3 Sf21细胞中的HCB基因的重组表达检测
• 3 结果与讨论
• 3.1 重组表达载体的外源基因插入位置
• 3.2 PCR鉴定重组病毒基因组中的HCB目的基因
• 3.3 SDS-PAGE检测HCB的表达
• 3.4 免疫印迹结果
• 3.5 蛋白酶活性检测
• 第二节 棉铃虫组织蛋白酶B基因重组病毒杀虫剂研究
• 1 材料
• 2 方法
• +的构建'>2.1 重组表达载体Bacmid-GFP-HCB-Polh⁺的构建
• +转染Sf21细胞、转染液感染Sf21细胞'>2.2 Bacmid-GFP-HCB-Polh⁺转染Sf21细胞、转染液感染Sf21细胞
• 2.3 重组病毒感染的Sf21细胞中外源基因的表达检测
• +感染棉铃虫幼虫'>2.4 重组病毒AcMNPV-HCB-GFP-Polh⁺感染棉铃虫幼虫
• 2.5 重组病毒感染棉铃虫幼虫后外源基因的表达检测
• 2.6 重组病毒杀虫生物活性检测
• 3 结果
• 3.1 重组表达载体构建结果和验证
• 3.2 Sf21感染细胞内GFP和polyhedrin的重组表达
• 3.3 Sf21感染细胞内HCB的表达
• 3.4 重组病毒感染棉铃虫幼虫外源基因的表达
• 3.5 重组病毒杀虫效果
• 4 讨论
• 参考文献
• 第二部分 棉铃虫表皮、精巢、卵巢细胞系建立
• 第一章 综述:昆虫细胞培养研究进展
• 1 体外培养、细胞系的概念及细胞系的鉴定
• 2 昆虫细胞培养基的发展和国内外建立昆虫细胞系的情况
• 3 昆虫细胞系的应用
• 4 棉铃虫细胞系的建立及研究意义
• 第二章 棉铃虫表皮细胞系的建立
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 棉铃虫表皮细胞原代培养
• 2.2 传代培养
• 2.3 细胞的冻存
• 2.4 细胞的复苏
• 2.5 细胞生长曲线和群体倍增时间的测定
• 2.6 染色体分析
• 2.7 病毒敏感性检测
• 2.8 同工酶检测
• 2.9 细胞克隆化培养
• 3 结果
• 3.1 棉铃虫表皮细胞系SDU-Ha-Epi的形成
• 3.2 细胞的保存、复苏
• 3.3 细胞生长规律和群体倍增时间
• 3.4 染色体分析
• 3.5 病毒敏感性
• 3.6 同工酶检测结果
• 3.7 细胞克隆化培养
• 4 讨论
• 第三章 棉铃虫精巢及卵巢细胞系建立
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 原代培养方法
• 2.2 传代培养
• 2.3 细胞冻存和复苏
• 2.4 精巢细胞系细胞生长曲线和群体倍增时间的测定
• 2.5 精巢细胞系染色体分析
• 2.6 精巢细胞系病毒敏感性检测
• 2.7 精巢细胞系细胞克隆化培养
• 3 结果
• 3.1 棉铃虫精巢细胞系SDU-Ha-Spe的形成
• 3.2 精巢细胞系细胞的保存、复苏
• 3.3 精巢细胞系细胞生长规律和群体倍增时间
• 3.4 精巢细胞系染色体分析
• 3.5 精巢细胞系病毒敏感性
• 3.6 精巢细胞系细胞克隆化培养
• 3.7 棉铃虫卵巢细胞系SDU-Ha-Ova的建立
• 4 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 致谢
• 已发表和拟发表的学术论文
• 学位论文评阅及答辩情况表