高致病性H5N1禽流感病毒HA1蛋白在毕赤酵母中的高效分泌表达及性质研究

论文摘要

高致病性禽流感病毒H5N1的爆发不仅给全世界养禽业造成了毁灭性打击,也严重危害到人类的生命安全,开发一种安全有效且广谱的疫苗是控制禽流感病毒传播的最有效的手段。毕赤酵母具有分子遗传操作简单、外源蛋白表达水平高、具有近似于哺乳动物细胞翻译后修饰与加工的功能,并且能进行高密度发酵。本研究利用毕赤酵母表达系统高效分泌表达了重组HA1蛋白,通过多种实验证明rHA1具有开发成H5N1禽流感广谱疫苗的可能性,在分子对接表位预测的基础上,鉴定了HA1上几个重要的中和表位的关键氨基酸,培养出了13D4-rHA1复合物晶体,为阐明H5N1病毒的保守中和抗体表位结构奠定了良好的基础。首先,将构建好的表达载体pPIC9K-HA1电转化进入毕赤酵母菌株GS115中,构建工程菌株,进行分泌表达。用G418筛选不同拷贝数的重组菌株,考察基因剂量对重组HA1蛋白表达的影响,实验证明适量提高拷贝数有利于提高rHA1的分泌表达量。优化了重组菌株的摇瓶培养条件,得到最佳诱导条件:初始pH值为5.4,甲醇浓度为1.0%,培养温度为25℃。在摇瓶培养的基础上,用10L发酵罐进行高密度发酵的工艺研究,发酵最终菌体浓度OD600约为320,rHA1的表达量为120mg/L比摇瓶培养提高了10倍左右,表明我们建立起了高效稳定的高密度发酵。缺失HA1N-端前48个氨基酸残基后,rHA1的表达量提高了～5倍（～550mg/L）,且保留了与代表性中和抗体的反应性,以及与HA1相当的免疫原性。发酵培养液上清通过切向流浓缩、更换缓冲液后,利用离子交换层析柱纯化,获得了较高纯度的重组HA1蛋白,蛋白回收率为24%左右。其次,利用本实验室已经筛选到的93株H5N1禽流感病毒单抗盘进行活性检测,结果显示重组蛋白HA1具有良好的抗原性。用重组HA1和HA1-48aa蛋白免疫小鼠5周后,anti-rHA1抗体滴度达到1.2×104和1.3×104,并具有较好的血凝抑制（HI）活性。体外阻断实验表明小鼠血清能较好地阻断13D4、8H5、8G9、10F7等广谱中和单抗与YU22病毒的结合,说明rHA1具备开发成H5N1禽流感的广谱疫苗的潜力。在本实验已有的广谱中和表位分子对接预测的工作基础上进一步应用突变分析方法进行实验验证。结果显示,Glu112,Lys113,Ile114对HA1上的构象表位的维持较为重要;Pro118和Tyr137是1A6和13H8构象表位的关键氨基酸;Asn165的突变可使广谱中和单抗13D4的结合活性下降40倍左右,但对其他广谱中和单抗的活性无显著的影响;aa123～aa132 loop区对HA1的构象活性很重要。最后,获得rHA1与广谱性中和单抗13D4Fab复合物的晶体培养条件,培养出可用于X-射线晶体衍射实验的体积约为0.2mm×0.2mm×0.05mm的方块状晶体,为HA1-13D4复合物空间结构的解析奠定了基础。

论文目录

• 目录
• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词
• 第一章 前言
• 一、禽流感
• 1.禽流感的病原学基础
• 2.禽流感病毒的分布与进化
• 3.H5N1的传播
• 4.禽流感病毒的诊断
• 5.高致病性禽流感病毒疫苗研发
• 6.禽流感病毒治疗药物
• 二、巴斯德毕赤酵母（PICHIA PASTORIS）表达系统
• 1.Pichia pastoris表达系统的特点
• 2.Pichia pastoris的生物学特点
• 3.菌株与表达载体
• 4.外源基因与宿主染色体的整合
• 5.外源蛋白分泌途径
• 6.外源蛋白的糖基化
• 三、蛋白质结构预测
• 1.蛋白质结构预测发展的必要性
• 2.蛋白质结构研究的实验方法
• 3.蛋白质结构研究的预测方法
• 4.蛋白质结构预测的应用
• 四、蛋白质晶体学
• 1.蛋白质晶体学的结晶原因与解析
• 2.蛋白质结晶过程
• 3.蛋白质晶体的培养方法
• 4.蛋白质结晶的影响因素
• 五、本研究的目的和意义
• 第二章 材料与方法
• 一、材料
• 1.主要仪器设备
• 2.菌株、质粒与酶
• 3.主要试剂
• 4.抗生素储备液的配置
• 5.培养基的配置
• 6.DNA操作相关溶液
• 7.SDS-PAGE电泳相关试剂
• 8.Western-Blot试剂
• 9.ELISA试剂
• 10.其它试剂配制
• 二、方法
• 1.DNA相关实验方法
• 2.P.pastoris酵母相关实验
• 3.重组酵母菌株的诱导表达
• 4.发酵罐高密度培养
• 5.蛋白质性质研究方法
• 6.重组蛋白质的纯化
• 7.结构模拟
• 8.蛋白质晶体培养
• 第三章 结果与分析
• 一、重组表达载体pPIC9K-HA1的构建与重组HA1蛋白的表达
• 1.重组表达载体pPIC9K-HA1的构建与转化
• 1.1 重组表达载体pPIC9K-HA1的构建
• 1.2 酵母电转化与转化子的筛选
• 2.重组HA1蛋白的高效分泌表达研究
• 2.1 重组蛋白的诱导表达
• 2.2 基因剂量与重组蛋白HA1分泌表达的关系
• 3.重组HA1蛋白在摇瓶中诱导表达条件的优化
• 3.1 甲醇诱导浓度对重组菌株生长与分泌表达的影响
• 3.2 诱导时不同起始pH值对重组菌株的生长与表达的影响
• 3.3 诱导温度对重组菌株的生长与表达的影响
• 3.4 诱导时间对重组HA1蛋白分泌表达的影响
• 3.5 单点突变对rHA1分泌表达的影响
• 4.发酵罐高密度发酵分泌表达rHA1
• 4.1 种子液的制备
• 4.2 甘油培养阶段
• 4.3 甲醇补料诱导阶段
• 4.4 分批补料发酵结果
• 5.N-端缺失对rHA1分泌表达量的影响
• 6.小结
• 二、重组HA1蛋白的纯化与性质研究
• 1.重组HA1蛋白的纯化
• 2.重组HA1蛋白的N-糖基化鉴定
• 3.MALDI-TOF-MS鉴定重组HA1蛋白
• 4.分析超离考察重组HA1蛋白在溶液中的状态
• 5.小结
• 三、重组HA1与HA1-48AA的活性检测
• 1.重组HA1与HA1-48aa的抗原性检测
• 1.1 93株单抗盘检测rHA1的生物活性
• 1.2 重组HA1与HA1-48aa抗原性的比较
• 2.重组HA1与HA1-48aa的免疫原性
• 2.1 重组HA1和HA1-48aa免疫小鼠血清的血凝抑制实验
• 2.2 阻断实验检测anti-rHA1和anti-rHA1-48aa小鼠血清生物活性
• 3.小结
• 四、HA1的表位分析
• 1.HA1上重要抗原位点的表位预测
• 112,Lys¹¹³,Ile¹¹⁴定点突变对rHA1活性的影响'>2.Glu¹¹²,Lys¹¹³,Ile¹¹⁴定点突变对rHA1活性的影响
• 118,Tyr¹³⁷定点突变对rHA1生物活性的影响'>3.Pro¹¹⁸,Tyr¹³⁷定点突变对rHA1生物活性的影响
• 165定点突变对rHA1上13D4活性的影响'>4.Ash¹⁶⁵定点突变对rHA1上13D4活性的影响
• 5.aa123～aa145 loop区突变后对rHA1活性的影响
• 6.小结
• 五、13D4 FAB与RHA1复合物晶体的培养研究
• 1.13D4Fab-rHA1复合物组分的确定
• 2.13D4Fab-rHA1复合物晶体的培养
• 3.小结
• 第四章 讨论
• 一、YU22 HA1与表达系统的选择
• 二、重组HA1蛋白的有效表达与发酵放大研究
• 1.摇瓶培养条件摸索
• 2.分批补料高密度发酵条件摸索
• 三、重组HA1蛋白的纯化与鉴定
• 四、RHA1和RHA1-48AA的活性检测
• 1.rHA1与rHA1-48aa的活性比较
• 2.rHA1成为疫苗的可能性
• 五、HA1的表位研究
• 1.蛋白质结构预测
• 2.分子对接的分析
• 3.实验验证表位位点
• 六、13D4FAB与RHA1复合物晶体研究
• 总结
• 展望
• 参考文献
• 致谢
• 在校期间发表文章