论文摘要
植物（几乎是所有其它的生物种类）对高温胁迫响应的一种方式是合成和积累热激蛋白（Heat shock protein,HSP）,在几乎所有的植物中都发现了一类分子量大约是100KDa的HSPs,与HSP60、HSP70和HSP90家族相似,HSP100蛋白家族的氨基酸序列和基因序列都有很高的同源性,组成了与细菌Clp蛋白酶同源的分子伴侣/蛋白酶体系,参与了细胞内的蛋白质量控制,调节了细胞的各种生理功能。ClpB是HSP100蛋白家族的一员,广泛存在于细菌、酵母和植物中,对生物体的基础耐热性和获得耐热性有重要意义。本实验室已经从番茄cDNA文库中克隆到定位于叶绿体的ClpB,命名为LeHSP100/ClpB。已有的研究结果表明,LeHSP100/ClpB受高温诱导表达,是热诱导型基因;利用反义技术抑制LeHSP100/ClpB在番茄中的表达后,导致转基因番茄的耐热性降低。为了进一步探讨LeHSP100/ClpB在植物耐逆过程中的作用,本论文利用农杆菌介导的方法使LeHSP100/ClpB在番茄中组成型表达,并对转基因番茄的耐冷性进行了检测。结果表明组成型表达的LeHSP100/ClpB能显著提高转基因番茄在低温弱光和低温强光条件下的耐受性,本论文主要结果如下:1组成型表达LeHSP100/ClpB番茄的获得将构建好的pROKⅡ-LeHSP100/ClpB植物表达载体,通过农杆菌介导的方法转染番茄,获得了组成型表达LeHSP100/ClpB的转基因番茄。Northern和Western杂交结果表明,25℃条件下,转基因番茄株系中可检测到LeHSP100/ClpBmRNA和LeHSP100/ClpB蛋白,说明导入的CaMV35S启动子驱动的LeHSP100/ClpB是组成型表达的。2组成型表达LeHSP100/ClpB提高了番茄的耐冷性（1）将正常生长至五叶期的转基因和对照番茄幼苗在低温弱光（4℃,光照强度约120μmol·m-2·s-1）和每天光照12 h的条件下进行处理21d后于室温下恢复7d。结果发现在4℃低温处理期间,两者外观上的差别不明显;但在恢复阶段,对照番茄快速呈现严重的冷害症状,叶片逐渐萎蔫,7d后全部死亡,而转基因的番茄在恢复期间仅出现轻微的冷害症状,呈现较强的耐冷表型,并且其Fv/Fm值和叶绿素含量等指标均明显高于对照番茄,说明组成型表达的LeHSP100/ClpB增强了番茄幼苗在低温弱光条件下的耐受性。（2）将正常生长至五叶期的转LeHSP100/ClpB基因番茄和对照番茄幼苗在低温强光（4℃,光照强度≥1000μmol·m-2·s-1）条件下处理3h后于室温弱光条件下进行恢复。结果表明转基因番茄较对照番茄其Fv/Fm值在胁迫过程中下降小,在恢复过程中上升快,说明组成型表达的LeHSP100/ClpB增强了番茄幼苗在低温强光条件下的耐受性。（3）将LeHSP100/ClpB反义株系进行了低温强光处理[同（2）],结果发现,与36℃预处理2h的对照株系比,反义株系的Fv/Fm值在胁迫过程中下降幅度大,且在恢复过程中上升慢,这也更加有力地证明了LeHSP100/ClpB增强了番茄幼苗在低温强光条件下的耐受性。