本文主要研究内容
作者孙超（2019）在《七-跨膜受体蛋白原位优化表达及功能研究》一文中研究指出：膜蛋白约占生物体内总蛋白数的20-30%,其中受体膜蛋白一直是生命科学和药物研发的热点。由于磷脂双分子层对膜蛋白的动态构象、信号转导,以及蛋白间的相互作用等具有重要的调制作用,尽可能地模拟膜蛋白所处的原生环境已成为对膜蛋白结构解析和功能研究的基本要求。然而,由于模拟膜的磷脂组成和不同重构方式终究无法重现原生膜环境,对膜蛋白结构和功能造成不同程度的影响,因此探索膜蛋白的优化表达和原位表征极为重要。七-跨膜受体蛋白是跨膜蛋白中最大的一个家族,根据其来源不同可以分为微生物类七-跨膜光受体蛋白和动物类七-跨膜受体蛋白。针对这两种不同类型的七-跨膜受体蛋白,本论文开展表达优化和原位表征研究。对于微生物类七-跨膜光受体蛋白,本论文选择古紫质-4(Archaerhodopsin-4,aR4)蛋白作为研究载体。aR4是在我国西藏扎北湖嗜盐菌H.sp.XZ515中发现的一种新型且未知结构的微生物类七-跨膜质子泵,因同时镶嵌有视黄醛及菌红素两个发色团而呈现紫红色,故称之为紫红膜。由于菌红素难以合成、且无法实现重构,因此无法采用模拟膜重构技术研究第二发色团菌红素在aR4蛋白中的作用。本工作首先利用嗜盐杆菌宿主细胞H.salinarum L33和H.salinarum MPK409分别实现aR4蛋白、内生磷脂与视黄醛第一发色团的同时表达,以及aR4蛋白、内生磷脂、视黄醛第一发色团与菌红素第二发色团的同时表达。进而采用二维固体核磁共振相关实验、光诱导瞬态吸收光谱实验、FTIR实验、稳定性测定、质子泵功能测定、pH滴定、动态光散射、以及ATP生成率测定等方法,深入研究了第二发色团菌红素对aR4键合区、质子泵功能和三聚结构的影响,并结合分子动力学模拟计算,在国际上首次报道了第二发色团菌红素对第一发色团视黄醛存在远程调控作用,建立了研究双发色团光受体蛋白的新方法。对于动物类七-跨膜受体蛋白,本论文以趋化因子受体CX3CR1在哺乳动物细胞HEK 293中的表达为例进行了两方面优化:1)将pcDNA4/TO四环素调控体系引入TRE-X 293细胞株;2)在CX3CR1的N末端引入Rho33序列,以期实现蛋白表达量的提高。在此基础上进一步探讨了将eGFP融合于CX3CR1的C末端的可行性,以期建立一种广泛适用于GPCRs的哺乳动物细胞调控表达及检测的平台。Western Blot检测和荧光结果显示融合蛋白Rho33-CX3CR1-eGFP的哺乳动物调控表达及检测平台构建成功,融合蛋白表达量得到了提升。这一体系的建立不仅有助于提高GPCRs在哺乳动物细胞中的表达,同时有利于细胞水平上GPCRs的动态观测以及GPCRs的原位功能研究。在此工作的基础上,本论文进一步构建了人源肾上腺素受体的两种融合蛋白WT-β3-AR-eGFP和W64R-β3-AR-eGFP,并利用激光共聚焦荧光显微镜初步探究了W64R突变亚型和野生型蛋白在胞内的定位,尝试解答W64R突变亚型致病的机理。尽管近年来膜蛋白结构的晶体解析取得了飞速发展,但由于生物膜自身组成的多样性、疏水性、流动性和不稳定性,原生膜环境下的蛋白结构解析和动态功能研究将是势在必行的发展趋势。本论文研究工作的开展,不仅对七-跨膜受体蛋白的优化表达和原位表征的重要性阐述具有重要的意义,同时对更深层次上认识七-跨膜受体蛋白功能与结构的关系也有一定的指导意义。此外,GPCRs与人类的多种疾病密切相关,本论文的工作为GPCRs结构的原位解析和以GPCRs为基础的药物设计提供了一定的实验基础。
Abstract
mo dan bai yao zhan sheng wu ti nei zong dan bai shu de 20-30%,ji zhong shou ti mo dan bai yi zhi shi sheng ming ke xue he yao wu yan fa de re dian 。you yu lin zhi shuang fen zi ceng dui mo dan bai de dong tai gou xiang 、xin hao zhuai dao ,yi ji dan bai jian de xiang hu zuo yong deng ju you chong yao de diao zhi zuo yong ,jin ke neng de mo ni mo dan bai suo chu de yuan sheng huan jing yi cheng wei dui mo dan bai jie gou jie xi he gong neng yan jiu de ji ben yao qiu 。ran er ,you yu mo ni mo de lin zhi zu cheng he bu tong chong gou fang shi zhong jiu mo fa chong xian yuan sheng mo huan jing ,dui mo dan bai jie gou he gong neng zao cheng bu tong cheng du de ying xiang ,yin ci tan suo mo dan bai de you hua biao da he yuan wei biao zheng ji wei chong yao 。qi -kua mo shou ti dan bai shi kua mo dan bai zhong zui da de yi ge jia zu ,gen ju ji lai yuan bu tong ke yi fen wei wei sheng wu lei qi -kua mo guang shou ti dan bai he dong wu lei qi -kua mo shou ti dan bai 。zhen dui zhe liang chong bu tong lei xing de qi -kua mo shou ti dan bai ,ben lun wen kai zhan biao da you hua he yuan wei biao zheng yan jiu 。dui yu wei sheng wu lei qi -kua mo guang shou ti dan bai ,ben lun wen shua ze gu zi zhi -4(Archaerhodopsin-4,aR4)dan bai zuo wei yan jiu zai ti 。aR4shi zai wo guo xi cang za bei hu shi yan jun H.sp.XZ515zhong fa xian de yi chong xin xing ju wei zhi jie gou de wei sheng wu lei qi -kua mo zhi zi beng ,yin tong shi rang qian you shi huang quan ji jun gong su liang ge fa se tuan er cheng xian zi gong se ,gu chen zhi wei zi gong mo 。you yu jun gong su nan yi ge cheng 、ju mo fa shi xian chong gou ,yin ci mo fa cai yong mo ni mo chong gou ji shu yan jiu di er fa se tuan jun gong su zai aR4dan bai zhong de zuo yong 。ben gong zuo shou xian li yong shi yan gan jun su zhu xi bao H.salinarum L33he H.salinarum MPK409fen bie shi xian aR4dan bai 、nei sheng lin zhi yu shi huang quan di yi fa se tuan de tong shi biao da ,yi ji aR4dan bai 、nei sheng lin zhi 、shi huang quan di yi fa se tuan yu jun gong su di er fa se tuan de tong shi biao da 。jin er cai yong er wei gu ti he ci gong zhen xiang guan shi yan 、guang you dao shun tai xi shou guang pu shi yan 、FTIRshi yan 、wen ding xing ce ding 、zhi zi beng gong neng ce ding 、pHdi ding 、dong tai guang san she 、yi ji ATPsheng cheng lv ce ding deng fang fa ,shen ru yan jiu le di er fa se tuan jun gong su dui aR4jian ge ou 、zhi zi beng gong neng he san ju jie gou de ying xiang ,bing jie ge fen zi dong li xue mo ni ji suan ,zai guo ji shang shou ci bao dao le di er fa se tuan jun gong su dui di yi fa se tuan shi huang quan cun zai yuan cheng diao kong zuo yong ,jian li le yan jiu shuang fa se tuan guang shou ti dan bai de xin fang fa 。dui yu dong wu lei qi -kua mo shou ti dan bai ,ben lun wen yi qu hua yin zi shou ti CX3CR1zai bu ru dong wu xi bao HEK 293zhong de biao da wei li jin hang le liang fang mian you hua :1)jiang pcDNA4/TOsi huan su diao kong ti ji yin ru TRE-X 293xi bao zhu ;2)zai CX3CR1de Nmo duan yin ru Rho33xu lie ,yi ji shi xian dan bai biao da liang de di gao 。zai ci ji chu shang jin yi bu tan tao le jiang eGFProng ge yu CX3CR1de Cmo duan de ke hang xing ,yi ji jian li yi chong an fan kuo yong yu GPCRsde bu ru dong wu xi bao diao kong biao da ji jian ce de ping tai 。Western Blotjian ce he ying guang jie guo xian shi rong ge dan bai Rho33-CX3CR1-eGFPde bu ru dong wu diao kong biao da ji jian ce ping tai gou jian cheng gong ,rong ge dan bai biao da liang de dao le di sheng 。zhe yi ti ji de jian li bu jin you zhu yu di gao GPCRszai bu ru dong wu xi bao zhong de biao da ,tong shi you li yu xi bao shui ping shang GPCRsde dong tai guan ce yi ji GPCRsde yuan wei gong neng yan jiu 。zai ci gong zuo de ji chu shang ,ben lun wen jin yi bu gou jian le ren yuan shen shang xian su shou ti de liang chong rong ge dan bai WT-β3-AR-eGFPhe W64R-β3-AR-eGFP,bing li yong ji guang gong ju jiao ying guang xian wei jing chu bu tan jiu le W64Rtu bian ya xing he ye sheng xing dan bai zai bao nei de ding wei ,chang shi jie da W64Rtu bian ya xing zhi bing de ji li 。jin guan jin nian lai mo dan bai jie gou de jing ti jie xi qu de le fei su fa zhan ,dan you yu sheng wu mo zi shen zu cheng de duo yang xing 、shu shui xing 、liu dong xing he bu wen ding xing ,yuan sheng mo huan jing xia de dan bai jie gou jie xi he dong tai gong neng yan jiu jiang shi shi zai bi hang de fa zhan qu shi 。ben lun wen yan jiu gong zuo de kai zhan ,bu jin dui qi -kua mo shou ti dan bai de you hua biao da he yuan wei biao zheng de chong yao xing chan shu ju you chong yao de yi yi ,tong shi dui geng shen ceng ci shang ren shi qi -kua mo shou ti dan bai gong neng yu jie gou de guan ji ye you yi ding de zhi dao yi yi 。ci wai ,GPCRsyu ren lei de duo chong ji bing mi qie xiang guan ,ben lun wen de gong zuo wei GPCRsjie gou de yuan wei jie xi he yi GPCRswei ji chu de yao wu she ji di gong le yi ding de shi yan ji chu 。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自华东师范大学的孙超，发表于刊物华东师范大学2019-07-02论文，是一篇关于七跨膜受体蛋白论文,微生物视紫红质论文,古紫质论文,双发色团论文,蛋白偶联受体论文,原位表征论文,端修饰及四环素调控论文,荧光观测论文,华东师范大学2019-07-02论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自华东师范大学2019-07-02论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。
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