乙肝相关性肝病肝脏内干细胞样细胞的特性和定向分化

论文摘要

前言目前全球有3.5亿乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）慢性携带者,每年约1百万死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化、原发性肝癌。中国属HBV感染高流行国家,约有1.2亿慢性HBV携带者和3000万慢性乙型肝炎患者,这些慢性乙型肝炎患者很容易发展成肝硬化、肝癌。因此,慢性乙型肝炎是严重威胁人类健康的疾病之一,但是HBV的精确致病机制尚未完全阐明。尽管外科技术和各种辅助治疗手段的完善,但是肝脏的功能衰竭和肝癌手术切除后的复发和转移仍然是乙肝相关性肝病的主要死亡原因。因此,乙型肝炎病毒慢性感染导致的肝脏纤维化、肝硬化甚至肝细胞肝癌仍然是基础和临床研究的热点。尽管在肝脏病毒感染后所致的肝脏纤维化在一定的条件下可以实现逆转,但是目前的研究结果仅仅局限于动物模型中,尤其是在晚期肝硬化形成后,肝脏的病理改变已无法逆转。众所周知,人体多种组织器官中存在干细胞,这些细胞在器官损伤时是组织再生和修复。研究认为,组织器官中的干细胞与肿瘤细胞有着密切的关系且具有某些共同特征。最近的研究表明,组织器官中的成体干细胞可能是组织细胞发生恶性转化的靶细胞。在发生组织损伤的器官中,慢性感染和组织再生可以导致组织正常的干细胞发生恶性转化而成为癌细胞,而这些发生恶性转化的干细胞就被称为肿瘤干细胞。乙型肝炎病毒的常常导致肝脏的慢性感染,漫长的病程有往往导致肝脏硬化和肝癌。干细胞样细胞在肝脏的慢性感染时发生富集且其数量与肝脏病变的严重程度呈显著的正相关,而这些干细胞直接参与了动物模型中肝癌的发生。因此肝脏干细胞可能在人类肝癌的形成中扮演了重要的角色,鉴定这些细胞将有助于我们对人体肝癌发生的理解和认识。新近的研究表明,在体外特定的诱导条件下,具有多向分化潜能的间充质干细胞（MSCs）在特定的诱导条件下可以通过间质—上皮（MET）途径分化为成熟肝细胞。同时有研究表明,间充质干细胞和纤维母细胞之间有着密切的关系,它们可能代表相同细胞的不同功能阶段。这些纤维母细胞不但表达间充质干细胞的表面标记,而且在特定的诱导条件下,这些细胞表现出多向分化潜能。因此,在以往很多研究中,间充质干细胞和纤维母细胞的概念经常交互使用。这些关于纤维母细胞的研究提示我们肝硬化肝脏内的纤维母细胞同样也可能具有干细胞的细胞特性。在本研究中,我们首先用免疫组化的方法观察了在肝硬化、肝癌和癌旁组织中干细胞表面标记的表达,将来源于乙肝肝硬化和肝癌癌旁组织中的细胞种植入BNX小鼠,以探讨这些细胞的致瘤特性。在体外实验中,我们进一步检测了不同来源的组织干细胞样细胞的增殖、自我更新和克隆能力。之后,在成功分离出肝硬化和肝癌组织中纤维母细胞后,用多种方法观察了这些纤维母细胞的干细胞表面标记的表达情况和分化潜能。我们认为,在体外的诱导条件下,肝硬化和肝癌组织内的纤维母细胞可以增殖和分化为具有分泌功能的成熟肝细胞的能力。材料和方法我们收集了我院20例手术切除的肝癌组织、相应的癌旁组织和10肝硬化组织标本。从以上的三种组织中我们分别挑选了5例组织进行和免疫缺陷小鼠的组织块种植和分离培养后的纤维母细胞的细胞种植。免疫组织化学染色（IHC）ABC法检测三种组织样本中c-kit、CD133、CD90、CD34、CK18和CK-19等。以PSB代替一抗作为阴性对照。分离不同组织样本中的纤维母细胞,分别以细胞免疫组化、流式细胞术、免疫荧光技术和蛋白免疫印迹技术等实验方法,观察纤维母细胞CD73、CD44、CD34、CD45、CD90、c-kit和CD133等标记进行了细胞免疫表型的分析,同时应用细胞免疫荧光的方法观察细胞中波形蛋白、结蛋白、纤维连接蛋白、α-平滑肌肌动蛋白、纤维母细胞特异抗原、CK-18、CK-19和白蛋白等的表达情况。在不同的体外培养的条件下,我们观察了来源于三种不同组织中的细胞的体外增殖、自我更新和克隆形成能力;同时,我们对来源于肝硬化肝脏和肝癌组织内的纤维母细胞细胞在不同的培养阶段的细胞形态变化和细胞内相关基因和蛋白的表达进行了观察。为了评估不同组织和组织细胞的致瘤特性,肝硬化和肝癌癌旁组织各5例样本在MEM培养基中被剪成1-2 mm3大小的组织块,然后用已经配制好的PBS液洗涤2次,各样本称取50毫克,以18号穿刺针无菌条件下接种于免疫缺陷小鼠左侧腋窝皮下,同时把4例来源于肝癌的纤维母细胞按1X10E6/只进行了细胞皮下注射。记录成瘤时间并计算成瘤率,观察移植瘤大小、形态、质地及活动度。五个月后,拉颈处死所有小鼠,切取肿瘤组织标本并分别行病理学检查（10%甲醛固定后,HE染色）及免疫组织化学检查。在成功分离不同组织样本中的纤维母细胞的基础上,采用体外诱导分化的方法,对不同来源的纤维母细胞向成熟肝细胞的分化特性进行了研究。结果对肝硬化、肝癌和癌旁组织中的干细胞表面标记的免疫组化分析结果显示,非癌组织中的干细胞标记的表达高于癌组织。不同组织内呈现不同的干细胞表达模式。CD34和CD90阳性表达部位多集中在增殖的胆管上,它们在细胞形态学上往往代表肝脏祖细胞;CD133和c-kit阳性细胞则多分布在肝或肝癌实质中,它们在形态和空间位置上类似过渡性的中间肝细胞。CK-18和CK-19阳性的细胞在多数的组织样本中都有表达,部分CK-18和CK-19阳性的细胞散在分布于硬化肝脏的实质组织中,它们在细胞形态上表现出肝细胞的圆核和多边形细胞膜,这些细胞代表过渡性肝细胞。体外实验也表明,来源于乙肝相关性肝硬化和肝癌癌旁组织内的细胞具有高度的增殖、自我更新和克隆形成能力。肝硬化肝脏和肝癌组织内的少数纤维母细胞表达间充质干细胞的细胞表面标记CD73和CD44而无骨髓造血干细胞的细胞表面标记CD34和CD45的表达;少部分的纤维母细胞表达干细胞表面标记CD90、c-kit和CD133。除了极少数的细胞表达α-平滑肌肌动蛋白外,几乎所有细胞表达波形蛋白、结蛋白、纤维连接蛋白、纤维母细胞特异抗原。此外,极少的细胞表达CK-18或CK-19但未发现白蛋白阳性细胞。在体外特异性的诱导条件下,肝硬化肝脏内的纤维母细胞以一种时间依赖的方式逐渐分化为肝细胞所特有的多边形细胞形态,而在此过程中伴随着不同肝系细胞蛋白标记的表达。纤维母细胞胞体由梭型或长梭形形态,培养2周后,胞体增大、变宽,形状不规则。培养4周后,细胞进一步缩短,变宽,随着培养时间的延长,细胞逐渐出现肝细胞典型的多边形。对肝硬化、肝癌和癌旁组织在BNX小鼠体内的成瘤性研究发现,种植了癌旁组织的两组共三只小鼠长出了肿块,肉眼观肿块直径大小都约1cm,组织HE染色表明肿块中心有大片的坏死区域,镜下观,组织实质由大量的实质细胞团块组成,且这些细胞具有高核/浆比,细胞的排列紊乱,失去正常的组织结构和极性。同时,组织免疫组化染色发现有CD133和c-kit阳性表达,而这些阳性细胞在形态学上都表现出卵圆细胞的特征。来源于肝癌、经过长期体外培养的纤维母细胞未发现在小鼠体内有肿块形成。结论在乙型肝炎引起的肝硬化、肝癌和癌旁组织中有多种干细胞表面标记的表达,这些干细胞表明标记呈现不同的表达模式并代表不同的细胞类型。来源于乙肝肝硬化和肝癌癌旁组织内的细胞具有高度的增殖、自我更新和克隆形成能力。这些组织内干细胞样细胞具有高度的致瘤特性,并可能存在着肝癌肿瘤干细胞。这些研究结果进一步完善了肝癌的复发和转移机制,为乙型肝炎引起的肝脏疾病的防治提供了新的思路。乙型肝炎慢性感染引起的肝硬化和肝细胞肝癌组织内的纤维母细胞具有间充质干细胞的细胞特性,在体外条件下,可以分化为具有特异性功能的成熟肝细胞。因此,这些纤维母细胞可以作为组织工程的肝脏肝细胞的来源。同时,肝硬化肝脏内的纤维母细胞通过间质—上皮转变（MET）分化为成熟肝细胞也提示,传统意义上的纤维母细胞在肝脏纤维化甚至肝硬化中的作用需要更深入的研究。

论文目录

• 缩略词表
• 论文摘要
• 中文摘要
• 英文摘要
• 论文正文
• 第一部分: 乙肝相关性肝硬化和肝癌癌旁组织内干细胞表面标记的表达和致瘤性研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分: 肝硬化组织中纤维母细胞的干细胞表型和体外分化
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分: 肝细胞肝癌组织中纤维母细胞的干细胞表型和体外分化
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 文献综述 肝脏干细胞的研究进展
• 正文
• 参考文献
• 在校期间发表论文
• 致谢