棕点湍蛙皮肤分泌液中抗菌肽的分离纯化、分子克隆及活性鉴定

论文摘要

抗菌肽（antimicrobial peptides, AMPs）是一类广泛存在于动植物体内有抗菌作用的活性多肽,具有广谱的抗菌活性,不仅可以抑制多种细菌和真菌,甚至在不伤及正常细胞的情况下抑制动物体内的肿瘤细胞。因此抗菌肽的研究已经成为基因工程、药物开发等领域的研究热点。在两栖动物特殊的生存环境中,抗菌肽是其防御机制中的主要成分。本论文主要通过生物化学和分子生物学的方法对棕点湍蛙皮肤分泌液中抗菌肽进行了分离纯化、分子克隆及活性鉴定。用无水乙醚刺激棕点湍蛙皮肤1-2min,收集皮肤分泌液,用500 ml含有0.01 MEDTA的0.1 M NaCl冲洗分泌液,快速离心（12000×g,20min）,收集上清液并真空冷冻干燥。该冻干样品用10 ml pH 6.0含有5 mM EDTA的0.1 M PBS（Na2HPO4-NaH2PO4）溶解,通过两步分离纯化过程Sephadex G-50凝胶过滤层析和反相高压液相层析（RP-HPLC）得到了一新家族的抗菌肽,通过Edman降解法得到其氨基酸序列为NILSSIVNGINRALSFFG。它由18个氨基酸残基组成,通过质谱分析得知其相对分子质量为1921.1 Da,这个结果与理论结果1921.0 Da很接近。利用棕点湍蛙的皮肤建立cDNA文库,并以cDNA文库为模板,根据蛙科抗菌肽信号肽的保守区设计5’引物（5′-CCAAA（G/C）ATGTTCACC（T/A）TGAAGAAA（T/C）-3′）,其反向引物为建文库过程中所用引物SMART cDNA synthesis（5’-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-3’）,通过PCR扩增得到400 bp左右的扩增产物,将产物酶连到载体PMD18-T中,转化到大肠杆菌DH1α中,氨苄青霉素板蓝白斑筛选,阳性克隆测序,得到抗菌肽全序列,命名为amolopin-p1。结果分析表明,此抗菌肽前体的组成与其它抗菌肽的序列组成很相似,但是成熟肽序列却完全不一样。通过对amolopin-p1抗菌肽活性检测得知该多肽对金黄色葡萄球菌和短小芽孢杆菌等敏感菌株有抗菌活性。通过圆二色谱分析可知,该多肽在水及Tris-HCl缓冲液中主要以β-sheet和无规则卷曲的状态存在。在Tris-HCl+SDS的缓冲液中,β-sheet的比率降低,α-helix的含量增加到3%。该多肽的溶血活性保持在3%左右。本研究还得到了一系列同源性很高的抗菌肽,GeneBank Accession Numbers:EU311540-EU311554.对上述克隆得到的抗菌肽序列用分子生物学软件进行遗传学分析,结果显示,编码棕点湍蛙皮肤抗菌肽前体的cDNA序列之间与编码间隔肽和成熟肽区域序列之间的碱基转换和颠换之比都大于1,说明大部分这些序列之间碱基转换的数量大于颠换,引起这些序列突变的原因更多的来源于碱基转换。进行同义突变与错义突变分析可知,上述四区域同义突变的比例较低,突变更多地表现为错义突变。本研究中克隆得到的15种棕点湍蛙皮肤抗菌肽的信号肽序列与其它一些抗菌肽相似性很高,但是成熟肽序列完全不一样,这说明,这些抗菌肽可能来自于同一个祖先。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号及缩略词对照表
• 第一章 文献综述
• 1 两栖类抗菌肽的理化性质及结构
• 1.1 两栖类抗菌肽的研究进展
• 1.2 两栖类抗菌肽的分类
• 1.3 两栖类抗菌肽的分子结构
• 2 两栖动物抗菌肽的作用机理
• 3 两栖类抗菌肽的功能
• 4 两栖类抗菌肽的应用
• 4.1 在农业中的应用
• 4.2 在畜牧生产中的应用
• 4.3 在医药中的应用
• 5 前景展望
• 参考文献
• 第二章 棕点湍蛙皮肤分泌液中抗菌肽的分离纯化及理化性质研究
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料、生化试剂及仪器设备
• 1.2 实验样品的收集处理方法
• 1.3 分离纯化
• 1.4 氨基酸序列及分子量测定
• 1.5 抗菌活性鉴定
• 1.6 溶血活性检测
• 1.7 圆二色谱分析
• 2 结果与分析
• 2.1 分离纯化结果
• 2.2 分子量及氨基酸序列分析
• 2.3 抗菌活性检测
• 2.4 溶血活性检测
• 2.5 圆二色谱结果分析
• 3 讨论
• 参考文献
• 第三章 棕点湍蛙皮肤分泌液及脑中抗菌肽的分子克隆
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料、生化试剂及仪器设备
• 1.2 棕点湍蛙皮肤cDNA文库的构建
• 1.3 棕点湍蛙脑cDNA文库的构建
• 1.4 分子克隆
• 1.5 数据分析
• 2 结果与分析
• 2.1 棕点湍蛙皮肤及脑cDNA文库的构建
• 2.2 分子克隆
• 2.3 序列比对分析
• 2.4 序列的遗传学分析
• 参考文献
• 创新之处
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文及相关获奖情况
• 致谢
• 附录