论文摘要
淇河鲫（Carassius auratus gibelio var）原产于河南省淇河,以生长快、味道美和效益高等优点而久负盛名,河南省人民政府已正式行文将其列入《河南省重点保护野生动物名录》并以第一名予以公布。为了繁荣市场,丰富人民生活,发展池塘养殖已变得日益迫切,对淇河鲫的生物学特性、生长变化规律等方面的研究已成为重要的课题。而动物的生长和发育受多种因素的调节和控制,包括遗传,营养,环境和内分泌等。在内分泌系统中,生长激素（GH）占据着中心调节作用的位置,它是由脑垂体间叶细胞分泌的一种多肽激素,具有调节生长发育,参与体内代谢调节,增进食欲,提高食物转化率等作用,然而垂体中GH含量极低,分离纯化比较困难,使得GH生理功能的进一步研究和应用受到限制。随着现代生物技术的发展,已有研究表明基因重组的GH与天然的GH一样具有生物活性,基因重组GH应用于研究和生产已经成为可能。因此,我们以淇河鲫作为研究对象,通过含肉率测定、肌肉生化成分分析,对其品质、营养价值作出初步评定,为淇河鲫营养生理的研究提供理论基础;用RT-PCR和RACE技术从淇河鲫垂体总RNA中扩增获得了淇河鲫GH全长cDNA序列,并对核苷酸和氨基酸序列进行了分析,构建了淇河鲫GH基因的原核和真核表达载体,获得了相应的重组基因工程菌,并对基因工程菌进行了诱导表达研究,为下一步开展淇河鲫GH的生物活性检测、转基因鱼研究以及研制开发成为安全、高效的新型调节鱼类生长的基因制剂奠定坚实的基础。主要结果如下:1)淇河鲫肌肉营养成分分析及营养价值评定淇河鲫是含肉率（65.72%）较高的鱼类;肌肉水分、蛋白质、脂肪、灰分含量分别为75.56%、19.39%、2.96%、1.17%;氨基酸分析表明,淇河鲫肌肉氨基酸总量（18.22%）、必需氨基酸量（7.37%）均较高,必需氨基酸占氨基酸总量的百分比（40.45%）和必需氨基酸与非必需氨基酸的比值（0.68）均符合WHO/FAO提出的40%左右和在0.60以上的要求,而且必需氨基酸含量高于婴儿需要量为底限的WHO/FAO评分模式;尤其是赖氨酸含量较丰富,达到鸡蛋蛋白质评分模式标准,较WHO/FAO评分模式高出30.0%,可以认为淇河鲫是一种营养丰富的优质鱼。2)克隆并获得了淇河鲫GH全长cDNA序列淇河鲫GH cDNA序列全长1191 bp,其中含Poly（A） 14 bp, 5’端非编码区长55 bp （含有在真核生物中高度保守的Kozak序列）,阅读框长633 bp,3’端非编码区长503bp（含真核生物mRNA前体3’剪切和加poly（A）尾的信号ATTAAA序列）,共编码210个氨基酸;编码的蛋白的分子量为23.78 ku。蛋白质结构分析表明淇河鲫GH信号肽为前22个氨基酸,成熟肽为188个氨基酸,成熟肽中有四个半胱氨酸（C）,形成两个二硫键,对GH的正常折叠、维持空间结构以发挥有效的生理功能有着重要作用。3)分析并揭示了淇河鲫GH基因结构和脊椎动物进化的关系通过对不同分类地位脊椎动物GH基因的核苷酸序列和氨基酸序列深入分析发现:①GH家族有三个非常保守的区域,以淇河鲫GH氨基酸序号为标准,第28位到第44位、第70位到第111位、第180位到第210位;特别是从第180位到第210位这个区域高度保守,含有的非极性氨基酸达10个（其中3个半胱氨酸）,为分子的疏水区,与GH分子的结构及稳定性有关;此外,除去信号肽部分,有30个氨基酸在所比较的动物中完全相同,可以认为这30个氨基酸残基对GH专一性、生物活性及空间构象有重要的作用。②成熟的GH是从一个共同的祖先进化而来,随着生物的进化过程,GH趋异进化成不同物种的GH分子;淇河鲫和鲤形目鱼类GH分歧较早,鲶形目鱼类的GH分歧次之,鲑鳟鱼类的GH分歧较晚,两栖类、禽类和哺乳类动物GH分歧最晚。4)构建了淇河鲫GH基因的原核表达载体并获得了重组蛋白本研究在原核表达载体pQE30上成功插入了淇河鲫GH基因,成功构建获得了pQE30-GH原核表达载体,通过测序验证构建的表达载体结构和序列正确无误。该载体经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳检测在约24 ku处获得了表达产物,经薄层扫描分析重组蛋白表达量较低,占菌体蛋白的6.6%。5)构建了淇河鲫GH基因毕赤酵母真核表达载体pPIC9K-GH,并获得了基因工程菌和重组蛋白。构建了淇河鲫GH基因真核表达载体pPIC9K-GH,该载体经电转化获得了整合有淇河鲫GH基因的重组毕赤酵母基因工程菌,重组菌经甲醇诱导后,成功获得了重组蛋白;表达条件优化试验结果表明,培养液的pH值、甲醇诱导浓度、诱导时间均对重组蛋白的表达有较大影响,其中诱导重组菌表达的适宜甲醇浓度为0.5～0.75%,适宜在弱偏碱性的培养液中表达,表达的最适pH值为7.0～7.5;诱导2天即达到最大表达量。
论文目录
摘要ABSTRACT第一章 鱼类生长激素的研究概况1.1 淇河鲫简介1.1.1 分类地位1.1.2 生物学特性1.1.3 生态习性1.2 鱼类 GH 的研究进展1.2.1 GH 及其家族1.2.2 GH 的结构1.2.3 GH 的合成、分泌和释放1.2.4 GH 的生理功能1.2.5 GH 的作用机制1.2.6 GH 基因的分离、克隆、表达与序列分析1.2.7 GH 的表达调控1.2.8 GH 的测定方法1.2.9 外源 GH 引入鱼体的途径和方法研究进展1.2.10 GH 在水产养殖中的应用1.3 本文研究的目的和意义第二章 淇河鲫肌肉营养成分分析及营养价值评定2.1 试验材料2.1.1 试验鱼2.1.2 试剂2.1.3 器具和仪器2.2 试验方法2.2.1 含肉率的测定2.2.2 生化成分分析2.3 结果2.3.1 含肉率2.3.2 常规营养成分及含量2.3.3 肌肉中氨基酸的组成及含量2.4 讨论2.4.1 淇河鲫和其它鱼类含肉率的比较2.4.2 淇河鲫和其它鱼类常规营养特性的比较分析2.5 小结第三章 淇河鲫生长激素基因CDNA 的克隆与序列分析3.1 试验材料3.1.1 克隆质粒和菌株3.1.2 主要药品和试剂3.1.3 主要仪器设备3.1.4 培养基3.1.5 溶液3.1.6 试验鱼3.2 试验方法3.2.1 引物的设计和合成3.2.2 淇河鲫垂体总 RNA 的提取和检测3.2.3 淇河鲫脑垂体总 RNA 的反转录3.2.4 淇河鲫 GH cDNA 部分片段的扩增3.2.5 淇河鲫 GH cDNA 3’端（下游区）片段的扩增3.2.6 淇河鲫 GH cDNA 5’端（上游区）片段的扩增3.2.7 目的片段的回收纯化3.2.8 回收后 PCR 产物的连接反应3.2.9 大肠杆菌感受态细胞的制备及其转化3.2.10 重组质粒的筛选、克隆及保菌3.2.11 重组质粒DNA 的少量提取3.2.12 重组质粒的鉴定3.2.13 重组质粒DNA 序列测定、DNA 序列分析和氨基酸序列的比较及系统进化树的构建3.3 结果3.3.1 淇河鲫垂体总 RNA 的提取3.3.2 淇河鲫 GH cDNA 部分片段的扩增3.3.3 淇河鲫 GH cDNA 3’端序列的克隆3.3.4 淇河鲫 GH cDNA 5’端序列的克隆3.3.5 淇河鲫 GH cDNA 碱基序列与其它动物的同源性比较3.3.6 淇河鲫 GH 氨基酸成分分析3.3.7 不同动物 GH 氨基酸序列的同源性比较分析3.3.8 鱼类 GH 和其它脊椎动物 GH 的进化分析3.4 讨论3.5 小结第四章 淇河鲫生长激素基因在大肠杆菌中的表达研究4.1 试验材料4.1.1 菌株与质粒4.1.2 主要药品和试剂4.1.3 主要仪器设备4.1.4 培养基4.1.5 常用溶液及缓冲液4.2 试验方法4.2.1 构建淇河鲫GH 基因原核表达载体的PCR 引物设计4.2.2 淇河鲫GH 成熟肽序列的PCR 扩增4.2.3 低溶点琼脂糖凝胶电泳回收、纯化、PCR 产物连接至pMD19-T 载体、转化及蓝白斑筛选、克隆及保菌4.2.4 菌落PCR，检测菌落中插入片段的长度4.2.5 将阳性菌落提取质粒DNA4.2.6 淇河鲫GH 基因原核表达载体的构建4.2.7 重组工程菌的诱导表达4.2.8 SDS-PAGE 电泳检测4.3 结果4.3.1 淇河鲫GH 成熟肽PCR 扩增4.3.2 菌落PCR，检测菌落中插入片段的长度4.3.3 淇河鲫GH 原核表达质粒PQE30－GH 的构建及检测4.3.4 重组菌的诱导表达4.4 讨论4.5 小结第五章 淇河鲫生长激素基因在毕赤酵母菌中的表达研究5.1 试验材料5.1.1 菌株与质粒5.1.2 主要药品和试剂5.1.3 主要仪器设备5.1.4 储液和培养基5.2 试验方法5.2.1 构建淇河鲫GH 基因真核表达载体的PCR 引物设计5.2.2 淇河鲫GH 成熟肽序列的PCR 扩增5.2.3 低溶点琼脂糖凝胶电泳回收、纯化、PCR 产物连接至pMD19-T 载体、转化及蓝白斑筛选、克隆及保菌5.2.4 菌落PCR，检测菌落中插入片段的长度5.2.5 将阳性菌落提取质粒DNA5.2.6 表达质粒pPIC9k－GH 的构建5.2.7 重组毕赤酵母工程菌的制备5.2.8 重组毕赤酵母工程菌的诱导表达条件筛选5.2.9 表达产物的纯化和活性检测5.3 结果5.3.1 淇河鲫GH 成熟肽PCR 扩增5.3.2 菌落PCR，检测菌落中插入片段的长度5.3.3 淇河鲫GH 基因真核表达载体构建5.3.4 重组毕赤酵母工程菌的诱导表达5.4 讨论5.5 小结结论参考文献附表附图致谢个人简介
相关论文文献
标签：淇河鲫论文; 肌肉营养论文; 生长激素基因论文; 序列论文; 表达论文;
淇河鲫肌肉营养成分分析及生长激素基因cDNA克隆和表达的研究
下载Doc文档