棉花（Gossypium hirsutum L.）GhMAP1-LC3基因的表达特征与抗血清的制备

论文摘要

棉花（Gossypium hirsutum L.）GhMAP1-LC3基因是在本实验室前期工作中克隆到的,其氨基酸序列与微管结合蛋白1A（MAP1A）和1B（MaP1B）的第三条轻链（LC3）保守区的104个氨基酸残基完全匹配,因此推测其为棉花中的微管结合蛋白基因。 本研究以陆地棉石远321（Gossypium hirsutum L.）为材料,应用实时定量PCR技术分析了GhMAP1-LC3基因的表达特点并制备了能够专一识别MAP1-LC3蛋白的抗血清。主要结果如下: 1.采用CTAB-PVP法提取棉花各组织RNA,得到纯度高、完整性好的RNA。 2.利用实时定量PCR技术比较了GhMAP1-LC3基因在棉花各组织中的表达情况,在下胚轴、-3DPA胚珠、30DPA纤维与35DPA纤维中没有检测到该基因的表达,在胚根、叶片、花瓣、花药以及0DPA胚珠、5DPA胚珠、10DPA纤维、15DPA纤维、20DPA纤维、25DPA纤维中均检测到了GhMAP1-LC3基因的表达,其中以20DPA纤维中的表达量最高。 3.采用CTAB-PVP法提取棉花叶片基因组DNA,并应用基因特异性引物对其进行PCR扩增。基因组DNA的扩增产物与20DPA纤维cDNA的扩增产物大小相同,表明该基因不含内含子。 4.将该基因的开放读码框克隆至pET30a表达载体中,导入大肠杆菌JM109（DE3）菌株中诱导表达,得到占菌体总蛋白2%的目的蛋白表达量。 5.应用亲和柱层析及聚丙烯酰胺凝胶电泳回收技术纯化得到目的蛋白。 6.以纯化的蛋白免疫小鼠,得到抗血清,经Western blotting检测,可以专一识别MAP1-LC3蛋白。

论文目录

• 1 文献综述
• 1.1 引言
• 1.2 棉纤维发育过程
• 1.2.1 纤维原始细胞的分化和突起
• 1.2.2 纤维伸长
• 1.2.3 纤维细胞的次生壁增厚
• 1.2.4 脱水成熟
• 1.3 微管结合蛋白的研究进展
• 1.3.1微管的动力学特征
• 1.3.2 微管结合蛋白MAP1
• 1.3.3 LC3研究进展
• 1.3.4 微管的去稳定因子
• 1.3.5 植物中的微管结合蛋白
• 1.4 外源基因在大肠杆菌中的表达
• 1.4.1 转录起始与终止对基因表达的调控
• 1.4.2 翻译水平的调控
• 1.4.3 密码子的使用频率
• 1.4.4 外源表达蛋白的降解
• 1.4.5 融合蛋白的表达
• 1.5 本研究的目标
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 常用试剂及溶液配制
• 2.2.1 质粒与宿主菌
• 2.2.2 主要试剂
• 2.2.3 常用溶液及缓冲液的配制
• 2.2.4 RNA提取缓冲液的配制
• 2.2.5 DNA提取缓冲液的配制
• 2法制备大肠杆菌感受态所需试剂和溶液的配制:'>2.2.6 CaCl₂法制备大肠杆菌感受态所需试剂和溶液的配制:
• 2.2.7 大肠杆菌转化所需试剂和溶液的配制
• 2.2.8 碱裂解法小量制备质粒所需试剂和溶液的配制
• 2.2.9 SDS—PAGE所需的试剂和溶液的配制
• 2.2.10 Western杂交所需的试剂和溶液的配制
• 2.2.11 表达蛋白纯化相关溶液的配制
• 2.3 RNA的提取
• 2.3.1 CTAB-PVP法提取RNA的操作步骤
• 2.3.2 RNA电泳检测
• 2.3.3 RNA定量
• 2.4 实时定量PCR反应
• 2.4.1 反转录：cDNA第一链的合成
• 2.4.2 引物设计
• 2.4.3 实时定量PCR反应
• 2.5 棉花叶片总DNA的提取
• 2.5.1 棉花叶片总DNA的粗提
• 2.5.2 棉花叶片总DNA的纯化
• 2.5.3 棉花总DNA的电泳检测
• 2.5.4 棉花总DNA定量
• 2.6 原核表达载体的构建
• 2.6.1 引物的设计与PCR的扩增
• 2.6.2 大肠杆菌感受态的制备
• 2.6.3 PCR产物连接到pGEM-Teasy载体
• 2.6.4 连接产物对大肠杆菌的转化
• 2.6.5 重组质粒的PCR鉴定
• 2.6.6 碱裂解法小量制备质粒DNA
• 2.6.7 质粒的酶切、回收与连接
• 2.7 原核表达与目的蛋白纯化
• 2.7.1 外源基因在大肠杆菌中的表达
• 2.7.2 SDS聚丙烯酰胺电泳技术
• 2.7.3 亲和柱层析分离目的蛋白
• 2.7.4 SDS-PAGE纯化目的蛋白
• 2.7.5 透析袋的处理方法
• 2.7.6 电洗脱法回收凝胶中的蛋白质
• 2.7.7 蛋白质浓度的定量
• 2.8 抗血清的获得
• 2.9 Western印迹的实验方法
• 3 结果与分析
• 3.1 棉花不同组织RNA的提取
• 3.2 实时定量PCR的定量结果
• 3.3 棉花叶片总DNA的提取
• 3.4 原核表达载体的构建（PCR验证、酶切验证、测序）
• 3.5 GhMAP1-LC3基因的诱导表达
• 3.6 抗血清纯度的检验
• 4 讨论
• 4.1 以SYBR-GreenⅠ作为实时定量PCR荧光染料的特点
• 4.2 影响MAP1-LC3在大肠杆菌中表达的因素
• 4.2.1 原核表达诱导条件的优化
• 4.2.2 GhMAP1-LC3基因在大肠杆菌中不能获得高效表达原因的分析
• 4.3 LC3在棉纤维发育中生理功能的讨论
• 4.4 展望
• 参考文献
• 致谢