低剂量辐射对HMW-GS基因转化小麦的影响

论文摘要

本试验主要有两方面研究内容:1.用剂量为0.5KRad、1.0KRad和1.5Krad的γ射线照射孕穗期的小麦,开花期利用花粉管通道法将HMW-GS 5+10亚基基因导入小麦;2.用剂量为0.5KRad、1.0KRad、2.0KRad和5.0KRad的软γ射线照射小麦幼胚后诱导愈伤组织,恢复培养后用基因枪法导入HMW-GS5+10亚基基因。目的是利用辐射与遗传转化相结合的方法,将优质蛋白亚基HMW-GS5+10基因导入小麦中改良其品质,同时研究低剂量辐射对遗传转化的影响,确定促进小麦遗传转化的活体和幼胚的适宜照射剂量。主要研究结果如下:对13个基因型的幼胚进行培养效果研究。结果表明,分化率和培养力均存在基因型差异,而各基因型的出愈率差别不大。农大718、龙麦29和龙麦8培养力较高,是较理想的转化试材。三种外植体（幼胚、幼穗和成熟胚）培养效果表明,幼胚、成熟胚的出愈率基本相同,高于幼穗,且差异达极显著。分化率差异较大,高低趋势为幼胚＞幼穗＞成熟胚,培养力大小为幼胚＞成熟胚＞幼穗。可见幼胚是较理想的遗传转化外植体,但选择何种外植体作为试材还应考虑试验条件,取材方便与否等因素。以龙辐麦8、龙辐819、龙麦29、东大718、K1122和K234品种（系）的幼胚为试材,在三种培养基上（MS、2MS和B5）进行培养力的研究。6个品种（系）在三个培养基上的诱导率在93.98%～100%之间;在MS培养基上6份材料的平均分化率为26.7%,2MS培养基上为18.3%,而在B5培养基为1.7%。综合出愈率、分化率情况,对以上6个品种进行幼胚的离体培养,最适宜培养基为MS培养基。软γ射线照射后对愈伤组织增重量有影响,0.5KRad照射的愈伤组织增重量与对照差异不大,且随照射剂量的加大愈伤组织增重量呈递减趋势。龙麦29、龙辐819、农大718和龙辐麦8四个品种的幼胚辐射后接种在诱导培养基上,第14-16天左右出现增重量峰值,随着培养时间的增长愈伤组织重量呈递减趋势,随着剂量增加愈伤组织增重逐渐下降。超微结构观察表明软X射线照射小麦幼胚产生的愈伤组织会产生核膜断裂、质壁分离、线粒体空泡化、液泡数增多变大等现象,且随着照射剂量的增加其变化更明显。从形态和功能上分析辐射能够打破细胞自身防卫封闭系统,有利于外源基因导入。利用基因枪法将HMW-GS5+10亚基基因导入愈伤组织中,在照射剂量为0.5和1.0 KRad的软γ射线照射幼胚的处理中有4株经PCR和PCR-Southem杂交检测证实该基因已整合到受体基因组中。试验结果证实,转基因植株均为经过低剂量辐射处理得到的,且转化率明显高于对照;对照及其它辐射处理均没有获得转化植株。经SDS-PAGE电泳分析,利用花粉管通道法导入HMW-GS5+10亚基基因的龙辐麦8号和龙辐麦10号中,已在3株小麦中有HMW-GS5+10亚基基因的蛋白表达,经PCR和PCR-Southern杂交证实,目的基因已整合到这3株小麦基因组中。龙辐麦10号转化率为1.95‰;龙辐麦8号转化率为6.51‰。这3株小麦的照射剂量分别是:龙辐麦10号1株,剂量为1.0KRad;龙辐麦8号2株,剂量为0.5KRad。由此可认为,对小麦进行低剂量的辐射处理可提高其遗传转化率。低剂量辐射处理促进遗传转化的适宜剂量大致为:用γ射线照射孕穗期植株剂量为0.5KRad-1.0KRad;用软γ射线照射幼胚为0.5-1.0KRad。转基因品系除目的基因性状表达外,其它农艺性状也产生变化,主要是由于目的基因整合位点的随机性及基因间互作造成的。对转HMW-GS5+10基因的品系进行品质分析,其沉淀值、稳定时间、延伸性和面积较受体有较大提高。对转HMW-GS5+10基因的转基因品系进行SDS-PAGE凝胶电泳检测,高分子麦谷蛋白亚基组成均具有5亚基和10亚基,从蛋白质水平证实目的基因的表达。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 文献综述
• 1.1.1 植物基因工程研究的进展
• 1.1.2 小麦基因工程的研究进展
• 1.1.3 高分子谷蛋白（HMW）基因的遗传及与品质的关系
• 1.1.4 辐射诱变对作物遗传转化的影响
• 1.2 研究的目的及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.2 质粒的构建
• 2.3 质粒转化方法
• 2.3.1 花粉管通道法
• 2.3.2 基因枪转化法
• 2.4 转基因植株检测
• 2.4.1 植株叶片全DNA的提取
• 2.4.2 PCR扩增
• 2.4.3 POR—Southern杂交
• 2.5 HMW-GS高分子量麦谷蛋白亚基的测定
• 2.5.1 HMW-GS高分子量麦谷蛋白亚基的提取
• 2.5.2 蛋白分离
• 3 结果和分析
• 3.1 基因枪法转化小麦的研究
• 3.1.1 组织培养的基因型效应
• 3.1.2 低温处理的培养效果
• 3.1.3 不同外植体的培养效果
• 3.1.4 不同培养基的培养效果
• 3.1.5 照射后愈伤组织重量的变化
• 3.1.6 辐射处理后愈伤组织的超微结构的变化
• 3.1.7 基因枪转化5+10基因的植株再生及PCR检测
• 3.1.8 PCR—Southern杂交检测结果
• 3.2 花粉管通道法转化小麦
• 3.2.1 γ射线不同剂量照射对品种结实率的影响
• 1代SDS—PAGE电泳检测导入目的基因'>3.2.2 T₁代SDS—PAGE电泳检测导入目的基因
• 2代PCR扩增检测导入目的基因'>3.2.3 T₂代PCR扩增检测导入目的基因
• 2代PCR—Southern杂交检测目的基因'>3.2.4 T₂代PCR—Southern杂交检测目的基因
• 3.3 转基因品系农艺性状的分析
• 3.4 转基因品系品质性状的分析
• 4 讨论
• 4.1 关于转基因后代的性状多样性问题
• 4.2 照射后结实率、愈伤重量及超微结构变化
• 4.3 低剂量辐射对遗传转化的影响
• 4.4 基因枪转化法中辐射剂量的选择
• 5 结论
• 参考文献
• 图版说明
• 图版Ⅰ
• 图版Ⅱ
• 图版Ⅲ
• 图版Ⅳ
• 在读期间发表的学术论文及获奖成果
• 作者简历
• 致谢
• 附件