重组人干扰素α-2b包涵体蛋白的柱层析复性研究

论文摘要

干扰素α-2b（IFNα-2b）是具有广泛生物学活性的细胞因子，具有抗病毒、抑制肿瘤细胞增生、调节人体免疫功能等作用。该蛋白在基因重组的大肠杆菌中以包涵体的形式表达，需经体外重折叠复性恢复成具有天然构象的活性蛋白。层析复性技术是近年来出现的一个新的复性方法，由于它能显著地改进复性产率，而且能将复性与分离纯化合为一步，降低下游成本，所以是当前生物技术中的一个研究热点。本文采用层析复性方法，对重组人干扰素α-2b（rhIFNα-2b）的复性进行研究，并对复性条件进行优化，与常规的透析复性方法相比较，以期为蛋白质复性提供一种简便且适宜大规模应用的方法。用5L发酵罐制备得到了重组人干扰素α-2b包涵体，经过破胞离心，1L发酵液可以得到2.4g粗制包涵体。重组人干扰素α-2b包涵体经多次洗涤后，溶于含6mol／L盐酸胍的溶解液中，蛋白纯度可达60％左右。利用盐酸胍浓度梯度体积排阻层析（SEC）法对重组人干扰素α-2b进行复性。通过考察线性盐酸胍梯度下盐酸胍终浓度、梯度长度、流速、复性液中还原型／氧化型谷胱甘肽（GSH／GSSG）比例等因素，探索了盐酸胍梯度凝胶层析柱复性rhIFNα-2b的优化条件。结果表明，复性后rhIFNα-2b的蛋白回收率是透析复性法的1.5倍，蛋白活性收率为68.7％，比活为1.77×108IU／mg，纯度高达94％。以盐酸胍浓度梯度离子交换层析（IEC）作为蛋白质复性系统，能有效地复性重组人干扰素α-2b，并在复性的同时对蛋白进行了纯化。在流速为0.5ml／min，盐酸胍终浓度1.5mol／L，上样量为2.24mg的条件下，复性后重组人干扰素α-2b的比活为1.13×108IU／mg，蛋白回收率51.2％，蛋白活性收率为46.3％，纯度高于90％。疏水层析（HIC）法复性重组人干扰素α-2b。当流速为1ml／min，Buffer A和Buffer B中盐酸胍浓度为2mol／L，上样量为0.644mg时，复性后rhIFNα-2b的比活为2.34×108IU／mg，蛋白回收率37.2％，蛋白活性收率为57.2％，纯度高达92％。

论文目录

• 缩略词表
• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1 包涵体蛋白柱层析复性研究
• 1.1 包涵体的形成
• 1.2 影响蛋白质复性的因素
• 1.3 蛋白复性的传统方法
• 1.4 柱层析法复性蛋白
• 2 人干扰素 α-2b
• 2.1 人干扰素 α-2b 的结构
• 2.2 人干扰素 α-2b 的理化性质
• 2.3 人干扰素 α-2b 的生物学作用
• 3 本文的研究内容与意义
• 第二章 重组人干扰素 α-2b 包涵体的制备、洗涤、溶解及透析复性
• 1 实验材料与仪器
• 1.1 菌种与培养基
• 1.2 实验材料
• 1.3 实验仪器
• 2 实验方法
• 2.1 菌种的活化和培养
• 2.2 菌体的收集与破碎
• 2.3 包涵体的洗涤
• 2.4 包涵体的溶解
• 2.5 重组人干扰素 α-2b 的透析复性
• 3 分析方法
• 3.1 菌体浓度及 rhIFNα-2b 表达量测定
• 3.2 SDS-PAGE 电泳测定 rhIFNα-2b 含量
• 3.3 考马斯亮蓝法测定蛋白浓度
• 3.4 rhIFNα-2b生物学活性测定-微量细胞病变效应抑制（CPE）
• 4 实验结果与讨论
• 4.1 重组人干扰素 α-2b 的发酵
• 4.2 重组人干扰素 α-2b 包涵体的洗涤纯化与溶解
• 4.3 重组人干扰素 α-2b 的透析复性
• 5 结论
• 第三章 重组人干扰素 α-2b 包涵体的柱层析复性研究
• 1 实验材料与仪器
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验仪器
• 2 实验方法
• 2.1 盐酸胍浓度梯度凝胶过滤柱复性重组人干扰素 α-2b
• 2.2 离子交换层析法复性重组人干扰素 α-2b
• 2.3 疏水层析法复性重组人干扰素 α-2b
• 3 分析方法
• 3.1 重组人干扰素 α-2b 蛋白浓度测定
• 3.2 SDS-PAGE 电泳
• 3.3 重组人干扰素 α-2b 活性测定
• 4 实验结果与讨论
• 4.1 重组人干扰素 α-2b 的梯度凝胶过滤柱复性
• 4.1.1 盐酸胍浓度梯度凝胶过滤柱复性 rhIFNα-2b
• 4.1.2 Buffer A中盐酸胍浓度对 SEC 复性的影响
• 4.1.3 盐酸胍梯度长度对 SEC 复性的影响
• 4.1.4 GSH-GSSG 比例对 SEC 复性的影响
• 4.1.5 流速对 SEC 复性的影响
• 4.2 重组人干扰素 α-2b 的离子交换层析复性
• 4.2.1 盐酸胍浓度梯度离子交换层析复性 rhIFNα-2b
• 4.2.2 流速对 IEC 复性的影响
• 4.2.3 Buffer B 中盐酸胍浓度对 IEC 复性的影响
• 4.2.4 上样量对 IEC 复性的影响
• 4.3 重组人干扰素 α-2b 的疏水层析复性
• 4.3.1 疏水层析复性 rhIFNα-2b
• 4.3.2 上样样品中氯化钠浓度对蛋白沉淀的影响
• 4.3.3 Buffer A 和 Buffer B 中盐酸胍浓度对 HIC 复性的影响
• 4.3.4 流速对 HIC 复性的影响
• 4.3.5 上样量对 HIC 复性的影响
• 4.4 复性方法的比较
• 4.4.1 复性机理的比较
• 4.4.2 复性效果的比较
• 5 结论
• 参考文献
• 作者简介
• 致谢