论文摘要
人和动物的生理机能、生化代谢、行为表现等常以24 h为周期发生规律性变动,这种变化的节律称为昼夜节律。产生昼夜节律的结构基础是分子计时器—昼夜节律生物钟（circadian clock）。对于主导节律调节的一些重要基因,称之为生物钟基因。机体的各种内在昼夜节律性变化可在外界环境因素的作用下得到重设性调节,以使机体活动与环境变化达成和谐统一。引发和调控昼夜节律生物钟的分子机制是在钟输入信号（如光照、温度等）的作用下,若干钟基因、钟相关基因和钟控基因及其蛋白产物通过转录—翻译—翻译后事件的相互衔接,组成钟振荡器的自身调控反馈环路,实现钟信号的精确输出。其中作为环路中正向调节成分的核心钟基因Clock和Bmal1,已被证实不但24h节律性表达于中枢钟组织如视交叉上核与松果体,而且也表达于包括血细胞在内的各种外周钟组织。上述基因产物以杂二聚体形式形成正向转录因子,与下游钟基因Per（Period）、Cry（Cryptochromes）或tim （Timeless）启动子区的E-box元件结合,激活一系列基因的转录和翻译,因此,Clock和Bmal1在生物钟的分子振荡机制中被认为起着极其重要的作用。然而,有关人外周血淋巴细胞核心钟基因Clock和Bmal1的昼夜节律性转录在南极大陆特殊环境下有着怎样的表现,至今未明,这正是本文所要探讨的内容。目的探讨赴南极前后科考队员外周血淋巴细胞核心钟基因Clock和Bmal1的昼夜节律性表达规律,旨在解析、拓展特殊环境下人类外周免疫钟运行的分子调控机制。方法8名健康、男性中国南极科考队员志愿者,年龄24～30岁,平均25岁。赴南极前在昼夜节律模式条件（自然光制,16 h-light : 8 h-dark cycle, LD）下生活1周:室温25±1 oC,起床时间:7:00,睡眠时间（无光照期）:23:00～7:00,早餐时间:7:30～8:00,午餐时间:11:30～12:00,晚餐时间:5:30～6:00;睡眠时光照强度<0.1 Lux;受试者自由饮水,无烟酒嗜好,在过去6个月内未做过跨时区旅行和未接受过药物治疗,日常活动和饮食成分基本一致。随后在一昼夜内,随机选择2位受试者,每隔4 h抽取各自外周血6 ml,血样采集在4个不连续的随机昼夜内完成。分离其淋巴细胞,提取总RNA,逆转录为cDNA,采用实时荧光定量PCR方法,测定不同昼夜时点（zeitgeber time,ZT,共6个,每个时点n=8）每个样品中Clock和Bmal1基因的mRNA表达量,并以熔解曲线和凝胶电泳条带加以验证,通过余弦法和Clock Lab软件获取节律参数,并经振幅F检验分析是否存在昼夜节律性表达。选取相同8名男性科考队员,赴南极后生活一年,经历了极昼与极夜光照差异、季节与气候差异、气温与气压差异等自然环境变化。其昼夜模式生活条件、采血方式、取样时间、实验检测方法及数据统计学处理同上。结果1.科考队员赴南极前外周血淋巴细胞核心钟基因Clock和Bmal1的昼夜表达1.1在LD（16:8）光制下,科考队员外周血淋巴细胞钟基因Clock和Bmal1的mRNA表达呈现明显的昼夜节律性振荡（振幅F检验,P<0.05）;1.2 Clock基因的峰值相位-335.85±13.80,表达振幅3.46±1.27,中值-11.40±1.59,峰时和谷时分别位于ZT22和ZT10,峰时与谷时mRNA水平分别为-7.95±2.55和-14.85±1.32;1.3 Bmal1基因的峰值相位-307.12±108.17,表达振幅2.77±1.11 ,中值-5.50±1.32,峰时和谷时分别位于ZT20和ZT8,峰时与谷时mRNA水平分别为-2.74±0.71和-8.25±2.33;1.4 Clock和Bmal1昼夜节律性转录的比较:两个基因LD（16:8）光制下在所检测的6个昼夜时点中表达水平均有明显差异（P<0.05）,Clock基因的表达水平较Bmal1基因降低;从昼夜节律性参数比较看出,两个基因表达的峰值相位、振幅无差异（P>0.05）,而Clock基因转录的中值水平以及峰时mRNA水平和谷时mRNA水平均降低（P<0.05）,Clock峰时和谷时比Bmal1推后约2小时（P<0.05）。2.科考队员赴南极后外周血淋巴细胞核心钟基因Clock和Bmal1的昼夜表达2.1八名科考队员中分别有2人钟基因Clock、3人Bmal1的转录表达具有明显的昼夜节律性（振幅F检验,P<0.05）;2.2二人Clock基因的峰值相位-42.28±5.27,表达振幅0.79±0.29,中值-9.02±0.24,峰时和谷时分别位于ZT3和ZT15,峰时与谷时mRNA水平分别为-8.23±0.53和-9.81±0.05;2.3三人Bmal1基因的峰值相位-184.58±29.58,表达振幅1.04±0.65,中值-8.50±0.45,峰时和谷时分别位于ZT12和ZT24,峰时与谷时mRNA水平分别为-7.46±0.41和-9.54±1.04;2.4 Clock和Bmal1昼夜节律性转录的比较:存在昼夜节律性表达的两个基因[Clock （n=2）和Bmal1 （n=3）]在所检测的6个昼夜时点（除了ZT14）的表达水平及其昼夜节律性参数变化均无显著性差异（P>0.05）;2.5其他队员的上述两个基因不表现明显的昼夜节律性转录特征（振幅F检验,P>0.05）。这些无节律表达队员的Clock基因,除昼夜时点ZT22以外,在其它各时点的表达量均低于Bmal1基因（P<0.05）。3.科考队员赴南极前、后外周血淋巴细胞核心钟基因Clock和Bmal1昼夜节律性转录的比较3.1赴南极前、后钟基因Clock昼夜节律性表达的比较:赴南极后的Clock昼夜节律性表达,与赴南极前相比,除昼夜时点ZT18和ZT22以外,在其它时点的表达量均上调（P<0.05）。队员赴南极后Clock基因的节律性表达振幅减小、中值增大、谷时mRNA水平增大（P<0.05）,峰时和谷时分别推迟约5个小时。3.2赴南极前、后钟基因Bmal1昼夜节律性表达的比较:赴南极后的Bmal1昼夜节律性表达,与赴南极前相比,除昼夜时点ZT10和ZT14以外,在其它时点的表达量均下调（P<0.05）。队员赴南极后Bmal1基因的节律性表达峰值相位推后,振幅、中值和峰时mRNA水平均下降（P<0.05）,峰时和谷时分别推迟约16个小时。结论1.赴南极前,在LD（16:8）自然光制下,科考队员外周血淋巴细胞核心生物钟基因Clock和Bmal1的转录具有明显的昼夜节律性振荡特征;Clock转录的峰时和谷时分别位于ZT22和ZT10,Bmal1的峰时和谷时分别位于ZT20和ZT8;Clock基因各昼夜时点的表达水平、中值以及峰时mRNA水平和谷时mRNA水平较Bmal1基因的降低,Clock峰时和谷时比Bmal1推后约2小时。2.赴南极后,经历各种自然环境变化,相同8名队员中多数人上述两个基因不再表现明显的昼夜节律性转录特征,Clock基因除昼夜时点ZT22以外,在其它各时点的表达量均低于Bmal1基因。3.赴南极后,2人Clock基因、3人Bmal1基因的转录继续维持明显的昼夜节律性表达,其中Clock转录的峰时和谷时分别位于ZT3和ZT15,Bmal1的峰时和谷时分别位于ZT12和ZT24;两个基因在所检测的6个昼夜时点（ZT14除外）的表达水平及其昼夜节律性参数的相应变化基本一致。4.与赴南极前相比,赴南极后的Clock昼夜节律性表达,除昼夜时点ZT18和ZT22以外,在其它时点均为上调,节律振幅减小、中值增大、谷时mRNA水平增大,节律峰时和谷时分别推迟约5个小时。5.与赴南极前相比,赴南极后的Bmal1昼夜节律性表达,除昼夜时点ZT10和ZT14以外,在其它时点均为下调,节律峰值相位推后,振幅、中值、峰时mRNA水平均下降,节律峰时和谷时分别推迟约16个小时。