论文题目: 重组猪瘟病毒T细胞表位的猪细小病毒样颗粒亚单位疫苗研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 预防兽医学
作者: 范京惠
导师: 李一经
关键词: 猪瘟病毒,细胞表位抗原,猪细小病毒,基因,亚单位疫苗,免疫
文献来源: 东北农业大学
发表年度: 2005
论文摘要: 猪细小病毒(Procine parvovirus,PPV),属于细小病毒科(Parvoviridae)、细小病毒属的成员,是引起母猪繁殖障碍(reproductive failure)的主要病原体之一。各种不同类型的猪均可感染,引起母猪发生流产、胚胎死亡、胎儿畸形、胎儿木乃伊化及不孕等。猪瘟(Classical Swine Fever,CSF 或Hog Cholera,HC)则是由猪瘟病毒引起的一种高度接触性、热性传染病,是危害养猪业的主要传染病之一。猪瘟除了可以引起败血症之外,还可引起一系列其它临床表现,如妊娠母猪流产、胎儿畸形、淋巴细胞和血小板减少等免疫系统受损、继发或并发细菌或其他病毒感染等。而且各种年龄的猪均易感,给养猪业带来巨大的经济损失。因此,研制和开发具有良好的免疫保护作用的预防性和治疗性疫苗来接种健康猪群和感染者具有重要的现实意义。本研究以CSFV 的优势T 细胞表位E290(含CSFV 特异的辅助性和细胞毒性T 细胞表位)为基础,以PPV 的核衣壳蛋白VP2 基因为支架载体分子,来研制预防猪瘟和猪细小病毒病的病毒样颗粒疫苗的新思路,在国内外尚未见有类似报道。首先,对分离的PPV 毒株LJL12,在PK15 细胞上进行增殖,根据Genbank 报告的参考毒株VP2 基因的核苷酸序列,利用Oligo 和Primer5.0 等软件,设计合成一对引物,以LJL12 的DNA 为模板,应用PCR 扩增出长约1.7Kb 的VP2 基因片段,将该基因片段克隆到pMD–18T 载体,并进行了酶切、PCR 鉴定和序列测定,并将测序结果与Genbank 报告的其他毒株VP2 基因进行序列比较,发现与其他毒株的核苷酸同源性均在99%以上,推导的氨基酸同源性均在98%以上,说明LJL12 株VP2 基因的保守性很高。将从pMD-18T-VP2 中酶切纯化后的VP2 基因克隆至真核表达载体pMel BacA 的XhoⅠ和KpnⅠ之间的多克隆位点上,命名为PM-VP2。酶切和PCR 鉴定结果表明,获得了PPV VP2 基因与pMel BacA 质粒的阳性重组子。根据Brown 等报道的CSFV T 细胞表位E290 的基因序列,设计一对引物,使上下游引物之间重叠18 个碱基,并对酶促合成方式进行改良,采用普通的Taq 酶,扩增获得了大小约为60bp 多肽基因片段E290。将用酶促合成方法获得的E290 的基因,克隆至重组质粒PM-VP2 的VP2 基因5’端上游,并命名为PM-VP2-E290。对重组子PM-VP2-E290 进行酶切和序列测定,测定结果表明,扩增产物的序列与原设计的序列的同源性为100%。纯化重组子PM-VP2-E290 阳性质粒,并与Bac-N-Blue DNA 共转染昆虫细胞sf9,96h后收获重组病毒。重组杆状病毒DNA 分子的PCR 鉴定表明,获得了杆状病毒DNA 与E290-VP2 基因的重组子,命名为P-1 代病毒。将经过三次噬斑筛选纯化后的P-1 病毒接种于sf9 细胞上进行增殖,PCR 鉴定后完全纯化的病毒,命名为P-2 代病毒。并按同样方法制备高效价的P-3 代病毒,以备用于表达。将高效价的P-3代重组杆状病毒接种于形成50%单层的sf9细胞,4天后收获病变细胞,应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、免疫印迹(Western-blot)和免疫酶斑点技
论文目录:
目录
CONTENTS
摘要
ABSTRACT
1 引言
1.1 猪细小病毒病流行及免疫预防研究进展
1.1.1 PPV 的发生历史及在我国的流行情况
1.1.2 PPV 的病原学特征
1.1.3 PPV 的流行病学
1.1.4 PPV 的疫苗研究进展
1.2 猪瘟的流行及免疫防治研究进展
1.2.1 CSFV 的病原学分类及生物学特征
1.2.2 猪瘟疫苗研究进展
1.2.3 猪瘟病毒抗原表位研究进展
1.3 本研究的目的和意义
2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 质粒与菌株
2.1.2 病毒与细胞
2.1.3 实验动物
2.1.4 抗体及疫苗制剂
2.1.5 试剂
2.1.6 培养液及培养基
2.1.7 实验主要仪器设备
2.2 实验方法
2.2.1 猪细小病毒的分离及初步鉴定
2.2.2 VP2 基因的克隆与序列测定
2.2.3 猪瘟抗原表位E290 基因的扩增
2.2.4 重组载体的构建(即pM-VP2)
2.2.5 重组转座载体PM-VP2-E290 的构建
2.2.6 重组转座载体PM-VP2-E290 转染昆虫细胞
2.2.7 重组杆状病毒在昆虫细胞中的表达及表达产物的检测
2.2.8 表达产物的小鼠实验免疫研究
3 结果
3.1 分离病毒的血清学检测结果
3.2 VP2 基因的克隆与序列测定
3.2.1 PPV VP2 基因的PCR 扩增结果
3.2.2 重组质粒pMD–18T –VP2 的酶切鉴定
3.2.3 重组质粒pMD–18T–VP2 的PCR 鉴定
3.2.4 PPV VP2 基因的序列测定结果及序列分析
3.3 猪瘟抗原表位E290 基因的扩增
3.4 重组载体pM-VP2 的构建
3.5 重组转座载体PM-VP2-E290 的构建
3.5.1 重组质粒PM-VP2-E290 的酶切鉴定
3.5.2 重组质粒PM-VP2-E290 的序列测定
3.6 重组转座载体PM-VP2-E290 转染昆虫细胞
3.6.1 PM-VP2-E290 纯化质粒纯度和含量的测定
3.6.2 PM-VP2-E290 纯化质粒与杆状病毒共转染昆虫细胞
3.6.3 重组杆状病毒的噬斑纯化与鉴定
3.6.4 重组杆状病毒滴度的测定
3.7 重组杆状病毒在昆虫细胞中的表达及表达产物的检测
3.7.1 SDS-PAGE 检测表达产物
3.7.2 免疫印迹(Western-blot)分析
3.7.3 表达产物的Dot-ELISA 检测
3.7.4 表达产物的免疫电镜观察
3.8 表达产物的小鼠实验免疫研究
3.8.1 免疫小鼠血清中PPV 特异性抗体的动态变化
3.8.2 特异性CTL 对靶细胞的杀伤活性
4 讨论
4.1 安全性病毒样颗粒亚单位疫苗的设计
4.2 关于病毒样颗粒对小鼠免疫效力的研究
4.2.1 体液免疫方面
4.2.2 细胞免疫方面
4.3 PPV VP2 基因的序列分析
4.4 杆状病毒表达系统中的表达及免疫原性测定
4.5 有关实验方法的讨论
4.5.1 CSFV E290 多肽基因的扩增
4.5.2 小片段核酸的回收与鉴定
4.5.3 转染过程
4.5.4 不同条件对表达产量的影响
5 结论
参考文献
攻读学位期间发表的学术论文
附录
致谢
发布时间: 2005-10-31
参考文献
- [1].重组减毒细菌运送CD8～+T细胞表位的机理及携带新城疫病毒DNA 疫苗鼠伤寒沙门氏菌的免疫生物学特性研究[D]. 潘志明.扬州大学2004
- [2].重组卡介苗诱导T细胞免疫应答的分子、细胞机理研究[D]. 焦新安.扬州大学1999
- [3].PRRSV强弱毒感染后对PBMCs细胞嗜性和细胞因子产生情况的差异研究及HP-PRRSV T细胞表位的鉴定[D]. 王亚欣.中国农业科学院2012
相关论文
- [1].猪细小病毒基因组序列测定及结构蛋白基因的克隆、表达与基因免疫研究[D]. 赵俊龙.华中农业大学2001
- [2].猪细小病毒体外增殖的抑制因素、VP2基因变异及核酸疫苗的研究[D]. 魏战勇.南京农业大学2004
- [3].干扰RNA抑制猪瘟病毒增殖效果研究[D]. 徐兴然.吉林大学2005
- [4].猪繁殖与呼吸道综合征、猪瘟和猪圆环病毒病诊断DNA微阵列的构建及其检测技术研究[D]. 肖驰.四川农业大学2005
- [5].伪狂犬病毒重组猪细小病毒VP2基因活载体疫苗株的研究[D]. 罗燕.四川农业大学2005
- [6].猪细小病毒-伪狂犬病重组病毒活疫苗SA215（B）的研究[D]. 石谦.四川农业大学2005
- [7].猪瘟Shimen株致猪血管内皮细胞病变前后表达差异基因寻找及E2基因PK-15细胞表达[D]. 张永国.西北农林科技大学2005
- [8].猪瘟病毒C-株全长cDNA感染性的恢复及其标记疫苗的构建[D]. 张淼涛.西北农林科技大学2005
- [9].猪细小病毒非结构蛋白NS1和结构蛋白VP2的研究[D]. 卿柳庭.华中农业大学2005
- [10].抗猪瘟重组活载体疫苗及DNA疫苗的构建及其生物学特性分析[D]. 刘燕.中国农业科学院2006