重组ETEC K99蛋白和K88ac-STII融合蛋白的免疫原性研究

论文摘要

产肠毒素性大肠杆菌（Enterotoxin Escherichia coli,ETEC）是引起幼畜腹泻的主要病原之一,给畜牧业生产尤其是养猪业造成了巨大的经济损失。研究表明, K88ac、K99菌毛和ST肠毒素是产肠毒素性大肠杆菌主要的致病因子,它们在幼畜腹泻疫苗研制中具有重要的作用。根据公布的产肠毒素性大肠杆菌（Enterotoxin Escherichia coli,ETEC）的K99菌毛抗原的核苷酸序列（序列号:M35282）。设计特异性引物,通过PCR扩增得到K99菌毛抗原成熟肽基因,回收纯化后将K99基因连于克隆载体pBS-T上,通过PCR、酶切鉴定、测序,证明其中含有K99基因片段,命名为pBS-K99。将鉴定结果正确的重组质粒和原核表达载体质粒pET-28a用XhoI/NcoI分别双酶切,通过T4DNA连接酶将目的基因片段克隆入表达载体中,转化入BL21（DE3）大肠杆菌中,经IPTG诱导进行蛋白表达,SDS-PAGE、Western blotting检测所表达的蛋白。本研究在构建重组菌株BL21（DE3）（pET-28a-K99）和BL21（DE3）（pET28a-K88ac-STⅡ）的基础之上进一步作下述研究:采用IPTG诱导法分别对重组菌株BL21（DE3）（pET28a-K88ac-STⅡ）和BL21（DE3）（pET-28a-K99）进行诱导培养。SDS-PAGE凝胶电泳分析,重组菌株分别在约30KDa和18KDa处有特异性表达的蛋白条带,与预期分子量大小一致。在表达蛋白鉴定的基础之上,通过透析的方法对目标蛋白进行初步纯化回收。重复跑SDS-PAGE凝胶,切取目标蛋白条带将其装入特定孔径大小的透析袋中继续水平电泳,使得目标蛋白从凝胶中跑出,透析过夜后用PEG 6000调整定量蛋白的浓度约为3mg/mL,加入弗氏不完全佐剂作为重组蛋白疫苗。分别以重组蛋白疫苗、商品疫苗和PBS免疫仔猪,优化检测免疫抗体水平的间接ELISA条件,通过比较三个免疫组的抗体水平来评价表达蛋白作为免疫抗原的有效性。经IPTG诱导重组菌株BL21（DE3）（pET-28a-K99）进行蛋白表达,经SDS-PAGE分析,结果表明:所表达的蛋白表达产物分子量大小为18KDa,且表达量较高,表达蛋白经Western blotting检测表明:表达的K99蛋白能和ETEC（C83912）免疫的兔血清发生特异性结合,证明其具有反应原性。以重组蛋白疫苗、商品疫苗和PBS免疫仔猪,结果表明:重组蛋白免疫组、商品疫苗免疫组与PBS对照组抗体水平差异极显著（P<0.01）,重组蛋白免疫组和商品疫苗免疫组抗体水平差异不显著（P > 0.05）。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述:ETEC 的生物学特征及防治研究进展
• 1 ETEC 的细菌学特征
• 2 ETEC 的流行病学特征
• 2.1 传染源及传染途径
• 2.2 流行特征
• 3 ETEC 的毒力因子
• 3.1 菌毛
• 3.2 肠毒素
• 4 ETEC 的防治
• 4.1 抗生素治疗
• 4.2 微生态制剂治疗
• 4.3 疫苗预防
• 参考文献
• 第二章 实验研究
• 实验一 K99 菌毛抗原成熟肽基因的克隆与表达
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 K99 抗原成熟肽PCR 扩增结果
• 2.2 K99 抗原成熟肽基因的克隆和鉴定
• 2.3 K99 抗原成熟肽的亚克隆和鉴定
• 2.4 K99 抗原成熟肽基因表达及初步纯化结果
• 2.5 Western blotting 结果
• 3 小结
• 4 讨论
• 参考文献
• 实验二 K99 蛋白、K88AC-STⅡ融合蛋白的免疫原性研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 重组菌株表达蛋白的SDS-PAGE 分析
• 2.2 动物免疫
• 2.3 间接ELISA 方法的建立
• 2.4 免疫各组仔猪抗体水平的检测
• 3 小结
• 4 讨论
• 5 主要结论
• 6 创新点
• 参考文献
• 附录一 相关试剂配制
• 附录二 K99 抗原成熟肽基因的原核表达载体构建路线图
• 致谢
• 个人简历及发表论文
• 石河子大学硕士研究生学位论文导师评阅表