乳杆菌属胆汁盐水解酶的活性多样性、底物特异性及相关基因研究

论文摘要

胆汁盐水解酶水解不同的胆汁盐会对人体产生不同的作用,水解初级胆汁盐会增加次级胆酸的产生,水解牛磺酸胆汁盐会游离出牛磺酸,进而增加硫化物的产生。而水解次级胆汁盐和甘氨酸胆汁盐则不会产生上述危害作用。而目前在筛选益生菌,评价益生性的实验中,很少考虑到益生菌对不同胆汁盐水解的不同效果,绝大多数研究只采用一种或两种胆汁盐来考察胆汁盐水解酶活性,而且对胆汁盐水解酶有害的方面缺乏研究,也不清楚不同种乳杆菌胆汁盐水解酶对六种不同人胆汁盐的水解效率方面的差别,所以目前对不同种乳杆菌的胆汁盐水解酶的研究还不够充分,增加对不同种乳杆菌胆汁盐水解酶差别的了解,特别是底物特异性方面的认识会对益生菌的筛选工作提供重要的参考和依据,同时也是进一步确定胆汁盐水解酶对菌株、对宿主的功能和作用的重要判断依据。在本实验中,我们定量测定了8个种共16株乳杆菌对于模拟人胆汁盐的胆汁盐水解酶比酶活并进一步测定了16株乳杆菌对六种人胆汁单盐（GC, GDC, GCDC, TC, TCDC和TDC ）的胆汁盐水解酶比酶活。本实验结果表明,8种乳杆菌各有特点,其中首次发现L.helveticus、L.fermentum和L.galllinarum只具有牛磺酸胆汁盐水解活力而不具有甘氨酸胆汁盐水解活力,这说明这三种胆汁盐水解酶只识别氨基酸侧链而不受类固醇核心的影响。这个新发现进一步证实了微生物的胆汁盐水解酶不仅能够识别固醇侧链而且能够识别氨基酸侧链。在八种乳杆菌中, L.acidophilus具有最高的模拟人胆汁盐和GC、GDC、GCDC、TCDC、TDC的水解能力, L.acidophilus对于甘氨酸胆汁盐的水解活力比牛磺酸胆汁盐的水解活力高10倍以上,并且四株L. acidophilus菌株对模拟人胆汁盐的水解活力相差很大,比酶活范围从336.5 Umg-1到776.4Umg-1,相差一倍以上。与L.acidophilus不同,L.plantarum菌株间胆汁盐水解酶的比酶活相差不大,而且L.plantarum菌株对于不同人胆汁单盐的水解活力也没有明显差别。L.gasseri Am1表现出了最高的TC降解能力,L.gasseri的胆汁盐水解酶活性受到胆汁盐氨基酸侧链和类固醇核心的共同影响。L.casei和L.salivarius菌株没有表现出任何胆汁盐水解酶活性。我们还发现,相比在MRS培养基中,L.gasseri和L.acidophilus的胆汁盐水解酶活力在MRSB培养基中出现了很大程度的下降（最大下降80%）,而其他菌株则没有出现类似的下降。L.gasseri和L.acidophilus的胆汁盐水解酶活性远远高于其他菌株,之前有研究表明胆汁盐的存在能影响酶活力,这其中是否存在必然的联系还有待于进一步的研究发现和证实。不同胆汁盐水解酶基因的比对表明LA-bshA, LA-bshB, LG-bsh和LP-bsh1具有高的相似度（高于45%）, LP-bsh2, LP-bsh3和LP-bsh4同其他胆汁盐水解酶基因（LA-bshA, LA-bshB, LG-bsh and LP-bsh1）的相似度比较低（低于26.3%）。根据以前的研究结果和本实验的序列分析推测,LP-bsh2, LP-bsh3和LP-bsh4可能不编码胆汁盐水解酶。不同胆汁盐水解酶基因的比对发现胆汁盐水解酶基因活性位点的碱基序列是严格保守的,但是结合侧链则是不完全保守的,这一定程度上解释了乳杆菌胆汁盐水解酶在底物特异性方面的差别。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 益生菌及其益生性
• 1.1.1 乳杆菌概述
• 1.1.2 乳杆菌降解人体胆固醇水平
• 1.2 胆汁盐水解酶
• 1.2.1 胆汁盐水解酶概述
• 1.2.2 胆汁盐水解酶的功能
• 1.2.3 胆汁盐水解酶对宿主的作用
• 1.2.4 胆汁盐水解酶的底物特异性
• 1.3 人体胆汁盐
• 1.3.1 人胆汁盐的合成与种类
• 1.3.2 人胆汁盐对细菌的作用
• 1.4 乳杆菌与人胆汁盐的相互作用
• 1.4.1 益生菌对胆汁盐的耐受性
• 1.4.2 益生菌对胆汁盐的分解代谢作用
• 第二章 课题的研究意义和研究方案
• 2.1 研究意义
• 2.2 研究方案
• 第三章 乳杆菌胆汁盐水解酶酶活测定
• 3.1 仪器，试剂，材料
• 3.1.1 实验仪器
• 3.1.2 主要药品和试剂
• 3.1.3 实验菌株
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 菌种活化和保藏方法
• 3.2.2 革兰氏染色和形态观察
• 3.2.3 菌株生长曲线的测定
• 3.2.4 胆汁盐水解酶活测定
• 3.2.5 蛋白质浓度测定
• 3.2.6 数据分析
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 乳杆菌生长曲线
• 3.3.2 16 株乳杆菌胆汁盐水解酶酶活
• 3.3.3 MRS、MRSB 培养基中乳杆菌BSH 酶活的比较
• 第四章 乳杆菌BSH 基因的PCR 扩增及序列分析
• 4.1 仪器、试剂和材料
• 4.1.1 仪器
• 4.1.2 主要试剂
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 细菌总DNA 的提取
• 4.2.2 引物设计
• 4.2.3 PCR 反应
• 4.2.4 凝胶电泳
• 4.2.5 DNA 片段的纯化
• 4.2.6 分子克隆和测序
• 4.2.7 质粒DNA 提取
• 4.2.8 序列分析
• 4.3 实验结果及讨论
• 4.3.1 乳杆菌bsh 基因的克隆测序
• 4.3.2 胆汁盐水解酶氨基酸序列比对
• 第五章 乳杆菌BSH 基因敲除
• 5.1 仪器、试剂和材料
• 5.1.1 仪器
• 5.1.2 主要试剂
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 引物设计
• 5.2.2 PCR 扩增
• 5.2.3 凝胶电泳
• 5.2.4 载体构建
• 5.2.4.1 单交换基因敲除
• 5.2.4.2 双交换基因敲除
• 5.2.5 电转化及筛选方法
• 5.2.5.1 大肠杆菌电转化感受态制备
• 5.2.5.2 大肠杆菌电转化方案
• 5.2.5.3 乳杆菌电转化感受态细胞制备及电转化方案
• 第六章 结论与展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表或投稿的学术论文