论文摘要
木聚糖酶作为重要的工业酶制剂,在饲料、造纸、食品、医药以及生物能源等方面有着广阔的应用前景。燃料酒精被认为最有发展前景的可再生清洁能源之一。而木聚糖酶在实现木质纤维素生物转化生产乙醇中起着重要作用。本课题对筛选到的一株酸性木聚糖酶高产菌株IME-216进行形态观察和18SrDNA基因的分子系统进化分析,鉴定为黑曲霉（Aspergillus niger strain）。通过单因素和均匀设计试验,优化了黑曲霉菌株IME-216（Aspergillus niger strain IME-216）产胞外木聚糖酶的液体发酵条件,确定最佳产酶培养基为:玉米芯5.0%,麸皮0.5%,纤维物质1%,玉米浆1.1%,（NH4）2SO40.8%,蛋白胨0.8%,CaCO30.5%,KH2PO40.23%,MgSO4·7H2O 0.08%,微量元素（Mandels）0.08%,pH自然。最佳发酵条件为:接种量5%（2.0×107）,28℃,250rpm振荡培养96h。经优化培养,酶活力由50000 U/ml,提高到90000 U/ml,增加了近50%。由于发酵条件优化是对菌株产酶潜力的发掘,它对酶活的改善是有限的,为进一步提高酶活以适应工业生产的要求,本文运用分子生物学手段构建了一株分泌型高效表达木聚糖酶的酿酒酵母工业菌株。首先通过RT-PCR的方法获得黑曲霉菌株IME-216的内切-β-1,4-木聚糖酶（endo-β-1,4-xylanase）的cDNA序列。以酿酒酵母载体pUG6为基本骨架,用组成型的磷酸甘油激酶（phosphoglycerate kinase,PGK）强启动子取代原来的诱导型启动子,通过重叠延伸PCR的方法将其与α-factor信号肽,endo-xylanase成熟肽和细胞色素c（Cytochrome c transcription,CYC1）的终止子融合,得到的融合片段插入载体pUG6的SpeⅠ和SacⅡ位点,构成载体pUPX。为了获得木聚糖酶基因在酿酒酵母中的高拷贝整合,将扩增得到的2.2 kb的酿酒酵母rDNA序列和pUPX用SalⅠ酶切后相连,构成整合表达载体pUPXR。载体经内切酶kpnⅠ线性化后转化入酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌株YS2,青霉素双层平板筛选高拷贝阳性转化子。阳性转化子经鉴定后发酵,取发酵液SDS-PAGE电泳检测,可观察到明显的目的表达条带。重组的木聚糖酶表达菌株在刚果红平板上显示出非常明显的水解透明圈。