速生型刺槐AhDREB1基因遗传转化的研究

论文摘要

刺槐（Robinia pseudoacacia L．）是我国主要的造林树种之一，其材质、抗逆性、生物质产量等均具有独特的优势，通过基因工程手段进一步提高其耐盐能力，对于提高我国盐渍地的利用率具有重要的现实意义。植物耐盐基因工程和刺槐基因工程的研究成果为本研究奠定了坚实基础，使本研究的成功具备了可能性。本研究以刺槐的优良无性系——速生型刺槐为材料，以其不含腋芽的茎段为外植体，研究了茎段再生和遗传转化过程中诸多影响因素的不同组合，建立并优化了速生型刺槐高频再生系统和遗传转化体系，并将AhDREB1基因导入到速生型刺槐中；主要研究内容及结果如下：1．利用L9（34）正交设计，研究了6-BA、KT、NAA、IBA、蔗糖和苗龄等因素对速生型刺槐茎段再生、节段扩繁和组培苗生根的影响，建立了茎段外植体高效再生体系。通过试验确定了速生型刺槐茎段再生的最佳培养基为：MS+6-BA 1.5mg·L-1+NAA 0.75mg·L-1+KT 1.5mg·L-1；组培苗节段增殖的最佳培养基为：MS+6-BA 0.10mg·L-1+NAA 0.02mg·L-1；最佳生根培养基为：3／4MS+IBA 0.2mg·L-1+NAA 0.2mg·L-1+糖20g·L-1。2．不同苗龄的茎段再生能力存在差异，继代20d的茎段再生效果最好。3．通过Km浓度梯度试验，研究了Km对速生型刺槐茎段再生和组培苗增殖的影响；Km对茎段再生和组培苗的分化均有强烈的抑制作用，30mg·L-1即可抑制茎段的再生和非转化苗的生长，因此确定Km在遗传转化中适宜的选择压为30mg·L-1。4、Cef对农杆菌抑制效果的研究结果表明：当Cef浓度达到150mg·L-1时，菌液的OD600值接近于0，说明此浓度已能够抑制农杆菌的生长，而且此浓度没有对刺槐茎段再生和组培苗分化产生明显的副作用；因此，150mg·L-1是Cef作为抑菌剂的适宜浓度。5．通过预培养时间、菌液类型和共培养时间的L9（34）正交试验，对影响农杆菌转化效率的主要因素进行了研究，试验结果表明：预培养2d，菌液二次活化后加入10mg·L-1的AS，摇匀后用于侵染遗传转化率较高，侵染最佳时间为21min，侵染后共培养2d可获得较好的转化效果，选择压由低到高进行梯度选择可使转化率提高。6．运用PCR对抗性株系进行了分子检测，结果显示，目的基因AhDREB1已整合到速生型刺槐基因组中，并得到了两个抗性株系。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 引言
• 1.1 研究的目的和意义
• 1.2 植物耐盐基因工程研究进展
• 1.2.1 渗透调节相关基因
• 1.2.2 与信号传递和基因表达相关的调控基因
• +/H⁺逆向转运蛋白基因'>1.2.3 Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因
• 1.2.4 保护酶基因
• 1.2.5 编码一些逆境诱导转录因子的基因
• 1.3 刺槐基因工程研究进展
• 1.3.1 刺槐再生体系的研究进展
• 1.3.1.1 直接分化不定芽体系
• 1.3.1.2 愈伤组织再生体系
• 1.3.1.3 体细胞胚再生体系
• 1.3.1.4 原生质体再生系统
• 1.3.1.5 小结
• 1.3.2 刺槐遗传转化研究进展
• 1.3.3 小结
• 1.4 研究的主要内容及技术路线
• 2 速生型刺槐再生体系的优化
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 植物材料及试剂
• 2.1.2 实验仪器
• 2.1.3 处理方法
• 2.1.3.1 6-BA、NAA、KT不同配比对茎段不定芽再生的影响
• 2.1.3.2 6-BA、NAA不同配比对芽节段增殖的影响
• 2.1.3.3 不同无机盐浓度、糖浓度、IBA和NAA的不同组合对组培苗生根的影响
• 2.1.3.4 苗龄对茎段再生的影响
• 2.1.4 培养基配方设计
• 2.1.5 数据分析
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 6-BA、NAA、KT不同配比对茎段不定芽再生的影响
• 2.2.2 6-BA、NAA不同配比对芽节段增殖的影响
• 2.2.3 无机盐含量、糖浓度、IBA和NAA的不同组合对组培苗生根的影响
• 2.2.4 苗龄对茎段再生的影响
• 2.3 小结
• 3 速生型刺槐遗传转化系统的建立
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料与试剂
• 3.1.2 菌种与质粒
• 3.1.3 培养基配方
• 3.1.3.1 农杆菌培养基（YEP培养基）
• 3.1.3.2 遗传转化中所用培养基配方
• 3.1.4 主要仪器设备
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 农杆菌活化与培养
• 3.2.2 遗传转化程序
• 3.2.3 卡那霉素（Km）对刺槐茎段再生和组培苗增殖的影响
• 3.2.4 头孢霉素（Cef）对农杆菌抑制效果和对刺槐生长的影响
• 3.2.4.1 Cef对农杆菌的抑制效果
• 3.2.4.2 Cef对刺槐生长的影响
• 3.2.5 遗传转化条件的建立
• 3.2.5.1 侵染时间对抗性芽发生的影响
• 3.2.5.2 预培养时间、菌液类型、共培养时间对抗性芽发生的影响
• 3.2.5.3 乙酰丁香酮（AS）对抗性芽发生的影响
• 3.2.5.4 梯度筛选对抗性芽发生的影响
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 Km对刺槐茎段分化和组培苗增殖的影响
• 3.3.1.1 Km对茎段不定芽再生的影响
• 3.3.1.2 Km对组培苗增殖的影响
• 3.3.2 Cef对农杆菌抑制效果
• 3.3.3 Cef对刺槐生长的影响
• 3.3.4 侵染时间对抗性芽发生的影响
• 3.3.5 预培养时间、菌液类型、共培养时间对抗性芽发生的影响
• 3.3.6 乙酰丁香酮（AS）对抗性芽发生的影响
• 3.3.7 梯度选择对茎段抗性芽发生的影响
• 3.4 小结
• 4 转基因植株的检测
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 试剂
• 4.1.3 主要仪器
• 4.1.4 试验方法
• 4.1.4.1 改良CTAB法微量抽提转化植株总DNA
• 4.1.4.2 质粒DNA的提取
• 4.2 转基因植株的PCR鉴定
• 4.3 结果与分析
• 5 结论与讨论
• 5.1 结论
• 5.2 讨论
• 5.2.1 外源激素对刺槐再生体系建立的影响
• 5.2.2 刺槐组培苗生根的影响因素
• 5.2.2.1 外源激素对二倍体刺槐生根的影响
• 5.2.2.2 无机盐浓度培养基对刺槐组织培养苗根系生长发育的影响
• 5.2.2.3 糖浓度对组培苗生根的影响
• 5.2.3 不同继代天数茎段再生的影响
• 5.2.4 抗生素种类的选择及敏感性测定
• 5.2.5 酚类物质对遗传转化的影响
• 5.2.6 选择培养的选择方法
• 5.2.7 影响转化效率的主要因素
• 5.2.8 DNA提取纯度的影响因素
• 5.2.9 进一步研究的设想
• 参考文献
• 图版
• 个人简介
• 导师简介
• 致谢