人类GMP还原酶2（GMPR2）的结构与功能研究

论文摘要

嘌呤代谢是核苷酸代谢的核心过程，广泛参与细胞的生理生化过程，对于生物体的生长、发育、分化、增殖以及凋亡至关重要。GMP还原酶（GMPR，EC1.7.1.7）在辅酶NADPH的作用下催化GMP不可逆地脱氨生成IMP，并在重新利用胞内自由碱基和嘌呤核苷，维持腺嘌呤和鸟嘌呤核苷酸的平衡方面起着重要的作用。但目前对GMPR的作用机理、催化机制以及相关功能的研究还不清楚。本研究成功建立了人类GMPR2原核表达纯化系统，获得了高纯度（＞95％）的融合蛋白，并对其结构和功能进行了研究。采用汽相悬滴扩散法在4℃条件下培养出GMPR2与底物GMP的蛋白质晶体，收集和分析了该晶体的X-射线衍射数据，衍射分辨率为3.0 （?）。GMPR2晶体的空间群属于P3221晶系，晶胞参数分别为a=b=110.6 （?），c=209.8 （?）（α=β=90°，γ=120°）。以Thermotoga Maritima IMP脱氢酶（PDB ID：1VRD）的晶体结构为模型，采用分子置换法解析出GMP还原酶家族第一个成员，即人类GMPR2与GMP复合物的晶体结构（PDB ID：2A7R）。人类GMPR2晶体结构为四个亚基组成的同源四聚物，每个单体由11个α螺旋和14个β折叠组成，并且在核心位置都形成一个（a／β）8桶状结构。有趣的是，底物GMP通过与氨基酸残基Met269、Ser270、Arg286、Ser288和Gly290发生相互作用来结合GMPR2；这就使得GMP临近的柔性结合区域（残基268-289）的构像类似于一个可以转动的铰链门——GMP结合紧密则该区域构像闭合，不然则处于无序状态。与GMPR1和IMP脱氢酶家族的结构同源性比较表明它们的活化位点环（残基179-187）的构像相似。我们推测Cys186可能是GMPR2的活性位点，而残基129-133所在的环对结合NADPH起作用。该蛋白的晶体结构解析对于理解GMPR家族的功能活性起着重要的作用。根据GMPR2的晶体结构分析，我们对一些关键氨基酸残基进行了定点突变实验以研究它们的生化效应。实验结果表明Cys186和Thr188的突变对GMPR2影响很大，几乎使GMPR2的活性完全丧失；而Ser184和Asn132的突变会引起GMPR2的活性部分丧失。我们又对GMPR2的生物学功能进行了研究。逆转录PCR（RT-PCR）显示，GMPR2在人体多种组织及肝癌、肺癌、胃癌等组织中广泛表达。对基因芯片表达谱数据进行聚类分析，发现GMPR2的相关基因中包括APRIN、IFIT1等细胞增殖相关基因。绿荧光融合蛋白表达显示GMPR2在不同细胞中分布有所不同，COS-7细胞中定位于细胞质，而在AD293细胞中定位于细胞质和细胞核。用RNAi方法来抑制GMPR2在细胞内的表达，结果显示对细胞增殖水平（非沉默RNA做为对照：22.76±1.43％；三对SiRNA中GMPR2-1：25.12±1.84％；GMPR2-2：26.72±1.24％；GMPR2-3：21.34±1.72％）和细胞凋亡未见显著影响。但在AD293细胞中发现过表达GMPR2可以引起细胞增殖水平上升（对照：37.12±1.28％；GMPR2：58.36±1.53％），而对细胞凋亡无显著影响。本论文对GMPR2的晶体结构和生物学功能进行了研究。通过X—射线衍射法，我们首次得到并解析了GMPR家族成员之一，人类GMPR2与GMP复合物的晶体结构（PDB ID：2A7R），分析了GMPR2的三维结构特点及可能的催化作用位点；通过关键位置氨基酸的定点突变研究了它们的生化效应，并对相关的生物学功能（组织表达谱、芯片研究、亚细胞定位、RNAi及真核细胞过表达等）进行了研究。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 英文缩略词
• 第一章 前言GMP还原酶（GMPR）研究概述
• 1.1 GMPR的分布模式
• 1.2 GMPR的两种同工酶
• 1.3 GMPR的生理学功能
• 1.4 GMPR与IMPDH
• 第二章 人类GMPR2的三维结构研究
• Ⅰ.材料和方法
• 1.材料与试剂
• 2.方法
• Ⅱ.实验结果
• 1.GMPR2蛋白的表达与纯化
• 2.GMPR2与GMP复合物晶体的制备及数据收集
• 3.GMPR2与GMP复合物的晶体结构解析
• 3.1 晶体结构的解析及修正过程
• 3.2 最终模型的质量分析
• 3.3 GMPR2与GMP复合物的总体结构
• 3.4 GMPR2复合物的单体结构
• 3.5 底物结合与构像变化
• 3.6 GMPR2与GMPR1及IMPDH家族结构比较
• Ⅲ.讨论
• 1.GMPR家族晶体结构研究
• 2.人类GMPR2的保守位点和催化机制探讨
• 3.GMPR在嘌呤代谢进化中的地位探讨
• 4.本章基本结论
• 第二章 人类GMPR2的生物学功能研究
• Ⅰ.材料与方法
• 1.材料与试剂
• 2.实验方法
• Ⅱ.实验结果
• 1.GMPR2结构与生化关系研究
• 2.GMPR2的表达谱分析
• 2.1 MTC Panel分析
• 2.2 细胞系RT-PCR分析
• 2.3 基因芯片杂交分析
• 2.4 基因芯片聚类分析
• 3.GMPR2的亚细胞定位分析
• 4.GMPR在真核细胞中的表达
• 5.GMPR2与细胞周期的关系
• 6.GMPR2与细胞凋亡的关系
• Ⅲ.讨论
• 1.GMPR2的关键氨基酸位点分析
• 2.GMPR2的相关功能研究
• 2.1 GMPR2在GMPR家族中所处的地位
• 2.2 GMPR2的组织表达谱分析
• 2.3 GMPR2的基因芯片聚类分析
• 2.4 GMPR2的亚细胞定位分析
• 3.GMPR2与细胞周期和细胞凋亡的关系
• 4.本章基本结论
• 参考文献
• 综述:核苷酸代谢相关酶及疾病研究
• 附录
• 1.人GMPR2蛋白及核苷酸序列
• 2.博士期间发表的文章
• 3.致谢