偶氮还原酶的醌还原活性及其介导脱色应用

论文摘要

偶氮染料的生物降解已得到广泛研究,目前已考察了多种不同来源的偶氮还原酶,并利用这些偶氮还原酶基因构建了基因工程菌;但这些胞内过量表达了偶氮还原酶的基因工程茵并没有明显表现出较野生菌更强的脱色能力。本文对偶氮还原酶的醌还原活性及其在偶氮染料介导脱色中的应用展开了研究。利用NAD（P）H提供电子,AZR可还原醌类化合物。以甲萘醌为底物,AZR醌还原酶的最适pH=8,最适温度为50℃。50℃以下的热处理对AZR的醌还原酶活性基本没有影响。AZR还原甲萘醌的酶促反应遵循双底物乒乓反应机制。研究发现AZR对甲萘醌、2-羟基-1,4-萘醌（lawsone,LQ）、蒽醌-2-磺酸和蒽醌-2,6-二磺酸等萘醌和蒽醌类化合物都具有还原活性,其中甲萘醌为最适底物,但对苯醌没有活性。比较2种辅酶发现,NADPH存在下,AZR的酶活性更高。外加双香豆素是NADPH和甲萘醌的竞争性抑制剂,是甲基红和硝基呋喃的反竞争性抑制剂,抑制常数Ki分别为87.6、51.4、117.7和105.9μmol L-1。AZR还原醌类化合物遵循两电子的醌还原途径,其在Escherichia coli YB胞内的过量表达可提高细菌对氧化应激的耐受性。氧化还原介体能加速电子从最初电子供体传递到最终电子受体,从而使反应速率增大一到几个数量级。介体LQ的存在对胞内过量表达醌还原酶AZR的E.coli YB的脱色能力有显著的促进作用,0.2mmol L-1LQ存在下,E.coli YB仅需2h就可使苋菜红(1mmol L-1)脱色75%。与LQ相比,甲萘醌对脱色的促进效果较差,2.5mmol L-1甲萘醌存在下脱色70%需12h。LQ作介体时,E.coli YB介导脱色偶氮染料的最佳碳源为葡萄糖,菌的最佳投加量为0.7g L-1,E.coli YB对苋菜红的重复介导脱色能力稳定,12h内菌体能连续完成4次脱色。LQ的存在对于结构较复杂的2种偶氮染料酸性大红GR和活性艳红K-2BP的脱色也有促进作用。酸性红B的脱色代谢物可替代醌类化合物作为氧化原介体加速偶氮染料的脱色。外加10%（v/v）酸性红B(2mmol L-1)的脱色代谢物时,7h可脱色苋菜红80%以上。甲基氢醌预处理对E.coli JM109和厌氧污泥的介导脱色能力都有促进作用。0.5mmol L-1甲基氢醌预处理10min后在0.2mmol L-1LQ存在下,E.coli JM109 3h可脱色苋菜红70%左右,而污泥可在11h内脱色75%以上。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1 绪论
• 1.1 染料的分类、结构与生色机理
• 1.1.1 染料的分类
• 1.1.2 染料的结构与生色机理
• 1.2 偶氮染料的生产应用和危害
• 1.2.1 偶氮染料的生产与应用
• 1.2.2 偶氮染料的危害
• 1.3 偶氮染料的微生物处理
• 1.3.1 细菌脱色偶氮染料
• 1.3.2 丝状真菌和酵母菌降解偶氮染料
• 1.4 细菌脱色偶氮染料的机理
• 1.4.1 偶氮染料的直接酶脱色
• 1.4.2 介体参与的偶氮染料的生物脱色
• 1.4.3 偶氮呼吸脱色偶氮染料
• 1.4.4 生物无机化合物脱色偶氮染料
• 1.5 醌类化合物
• 1.5.1 醌类化合物及其应用
• 1.5.2 醌类化合物的毒性
• 1.6 醌还原酶
• 1.6.1 哺乳动物的醌还原酶
• 1.6.2 真菌的醌还原酶
• 1.6.3 细菌的醌还原酶
• 1.6.4 醌还原酶在醌解毒中发挥的作用
• 1.7 基因工程技术在环境工程中的应用
• 1.7.1 基因工程
• 1.7.2 基因工程菌在环境工程中的应用
• 1.8 本论文的研究内容及意义
• 1.8.1 前期工作有待解决的问题
• 1.8.2 研究内容及意义
• 2 实验材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌种及污泥来源
• 2.1.2 实验仪器
• 2.1.3 实验药品
• 2.1.4 培养基
• 2.2 研究方法
• 2.2.1 粗酶的提取
• 2.2.2 AZR的纯化
• 2.2.3 蛋白含量的测定
• 2.2.4 酶活分析体系
• 2.2.5 AZR的醌还原酶特性考察
• 2.2.6 AZR还原醌类化合物的机理考察
• 2.2.7 氧化应激对E.coli菌株存活率的影响
• 2.2.8 菌体生长及染料脱色的测定
• 2.2.9 介导脱色培养方法
• 2.2.10 偶氮染料还原电势的测定
• 2.2.11 MHQ预处理对介导脱色的影响
• 3 AZR的醌还原酶特性
• 3.1 pH和温度对AZR醌还原酶活性的影响
• 3.2 AZR醌还原酶的热稳定性
• 3.3 AZR还原醌类化合物
• 3.3.1 NADPH作辅酶时AZR对醌类化合物的还原
• 3.3.2 NADH作辅酶时AZR对醌类化合物的还原
• 3.4 双香豆素对AZR酶活的影响
• 3.5 本章小结
• 4 AZR抗氧化应激作用的研究
• 4.1 AZR还原醌类化合物的机理
• 4.2 氧化应激对E.coli菌株存活率的影响
• 4.3 本章小结
• 5 醌还原酶在偶氮染料介导脱色中的应用
• 5.1 E.coli菌株粗酶液酶活及完整细胞脱色苋菜红
• 5.2 醌类化合物对细菌脱色偶氮染料的影响
• 5.2.1 LQ对E.coli菌株脱色苋菜红的影响
• 5.2.2 甲萘醌对E.coli YB脱色苋菜红的影响
• 5.2.3 碳源对E.coli YB介导脱色苋菜红的影响
• 5.2.4 菌量对E.coli YB介导脱色苋菜红的影响
• 5.2.5 E.coli YB对苋菜红的连续介导脱色
• 5.2.6 LQ对E.coli YB脱色其它染料的影响
• 5.3 酸性红B脱色代谢物对细菌脱色苋菜红的影响
• 5.4 MHQ预处理对偶氮染料介导脱色的影响
• 5.4.1 MHQ预处理对E.coli JM109介导脱色苋菜红的影响
• 5.4.2 MHQ预处理对厌氧污泥介导脱色苋菜红的影响
• 5.5 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表学术论文情况
• 致谢