黄曲霉毒素氧化酶氧化作用机制的研究

论文摘要

本实验室前期已成功克隆和以原核系统表达了黄曲霉毒素氧化酶(AFO)，研究发现该酶能够催化底物发生氧化还原反应并产生H2O2。本研究在之前的基础上优化了酶的表达、纯化条件，以期得到原核表达的、有活性的E/AFO。探讨该酶催化氧化还原的机制。为进一步对E/AFO结构及功能的深入研究奠定基础。从AFO的一级序列及NCBI数据库检索发现AFO与来源于人类的二肽基肽酶III具有40.4%的同源性。但是二肽基肽酶属于水解酶类，而AFO是氧化还原酶，推测其氧化还原作用与金属离子有关。由此，本研究的主要目的是为AFO寻找其氧化还原作用的分子基础。研究的主要内容包括（1）回答AFO氧化还原作用是否与变价的金属离子有关，与何种金属离子相关；（2）观察AFO是否存在结合氧气的能力。由于AFO催化底物时伴随有H2O2的产生，并且催化反应中没有NADH或NADPH的参与，推测氧分子中的两个氧原子一个加在底物黄曲霉毒素上，另一个加在了水上而形成H2O2。所以，如果证实该酶对氧气的结合现象，将对上述推测是一个有力的支持。（3）AFO中的两个半胱氨酸是否会以分子内二硫键的方式存在，还是相反，以游离状态存在。这将对酶的分子稳定性或催化活性有重要的意义。经过改善以及优化表达条件，得到了原核表达的、有活性的E/AFO；通过优化纯化条件，得到了纯度为95%的E/AFO。利用二硫苏糖醇(DTT)能打开二硫键的特性，对透析除去金属离子后的E/AFO进行一系列实验。由实验结果发现DTT对E/AFO作用后既不能使酶分子结构发生改变，又没有热量的吸收或产生，可以肯定AFO不存在分子内二硫键，酶分子内的两个半胱氨酸是游离的，对AFO氧化还原态的光谱观察结果，也支持了该结论。用等温滴定微量热法和吸收光谱手段的研究发现AFO与铜离子之间存在着有效的结合反应；在铜离子存在的条件下，AFO表现出氧气结合的能力。结论：AFO与二肽基肽酶不同，是一个氧化还原酶。作为一个氧化还原酶，AFO的氧化还原作用与变价金属离子铜有关，每个AFO分子中结合一个铜离子，AFO氧化态与还原态之间发生的交换一个电子的反应可以由铜离子的存在而得到解释。AFO可以结合氧气，氧分子结合部位位于其中的铜离子。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 黄曲霉毒素简介
• 1.2 黄曲霉毒素氧化酶简介
• 1.3 蛋白质结构研究手段简介
• 1.4 等温滴定微量热法
• 1.5 研究背景、目的与意义
• 2 实验设备及材料
• 2.1 主要仪器设备
• 2.2 试剂
• 3 实验方法
• 3.1 MBP-AFO 融合蛋白的活性、高效诱导表达
• 3.2 MBP-AFO 融合蛋白的亲和层析
• 3.3 酶切 MBP-AFO 融合蛋白，释放 AFO
• 3.4 E/AFO 活性测定
• 3.5 MBP 标签的去除及去金属离子 E/AFO 的获得
• 3.6 关于 E/AFO 分子内是否存在二硫键的分析
• 3.7 关于 E/AFO 与铜离子相互作用的分析
• 3.8 E/AFO 与锌离子相互作用的分析
• 3.9 E/AFO 结合氧气的监测
• 4 实验结果
• 4.1 活性 E/AFO 表达条件的优化
• 4.2 优化发酵培养条件
• 4.3 纯化方法优化结果
• 4.4 原子发射光谱测定金属离子浓度结果
• 4.5 E/AFO 氧化还原作用机制的研究结果
• 5 讨论与分析
• 5.1 原核表达条件及纯化方法的优化
• 5.2 E/AFO 透析除金属离子
• 5.3 AFO 分子中两个半胱氨酸存在状态的分析
• 5.4 AFO 与金属离子相互作用的分析
• 5.5 AFO 与氧气相互作用分析
• 6 小结与展望
• 6.1 小结
• 6.2 展望
• 参考文献
• 致谢