根癌农杆菌介导的橡胶树胚性悬浮细胞遗传转化及植株再生研究

论文摘要

橡胶树胚性悬浮系及其植株再生体系的建立为橡胶树遗传转化的研究提供了良好的材料。本研究以橡胶树品种热研8-79胚性悬浮细胞为受体,研究了菌液浓度、共培养基pH值及添加乙酰丁香酮浓度、共培养温度、共培养时间及共培养方式对农杆菌介导的橡胶树胚性悬浮细胞遗传转化的影响,优化了转化条件。通过卡那霉素浓度梯度筛选获得了抗性愈伤组织系,并分化得到拟转化胚状体及再生植株。GUS组织化学染色、PCR检测、测序分析及Southern杂交结果表明,外源基因已经成功整合进入橡胶树基因组DNA中。为有目的地改良橡胶树性状、改良和开发橡胶树种质资源、提供有力工具,也为基因功能研究提供良好条件。主要结果如下：1.农杆菌介导的橡胶树胚性悬浮细胞遗传转化的影响因素研究：以GUS基因（uidA）瞬时表达频率和悬浮细胞存活率为指标,采用单因子实验设计对农杆菌菌液浓度、共培养基pH值、共培养基添加AS浓度、共培养温度、共培养时间及共培养方式6个因素进行研究,确定农杆菌介导的橡胶树胚性悬浮细胞遗传转化的适宜条件为：农杆菌菌液CD600值为0.3-0.5；共培养基pH值5.2；农杆菌重悬浮和共培养培养基中添加100-150μM的乙酰丁香酮；共培养温度20-22℃；共培养时间4-5 d；采用固体共培养方式共培养。2.抗性愈伤组织、胚状体及再生植株的获得：在农杆菌介导的橡胶树胚性悬浮细胞的遗传转化中,农杆菌抑菌选用300 mg/L的替卡西林；以卡那霉素作为选择抗生素,采用从低到高浓度梯度（50、75、100 mg/L）筛选的方式进行。在该方式下,总共获得10个抗性愈伤组织系,2177个拟转化胚状体,165株拟转化再生植株。3.分子检测：经GUS组织化学染色、PCR检测、测序分析和Southern杂交分析,确定外源基因npt-Ⅱ基因已经成功整合进入橡胶树基因组DNA中。4.本研究采用农杆菌介导法成功地对橡胶树胚性悬浮细胞进行了遗传转化,初步建立起了农杆菌介导的橡胶树胚性悬浮细胞遗传转化体系。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 1 序言
• 1.1 植物遗传转化研究进展
• 1.2 根癌农杆菌介导植物遗传转化
• 1.2.1 根癌农杆菌介导的遗传转化机理
• 1.2.2 农杆菌介导的遗传转化特点
• 1.2.3 农杆菌介导植物遗传转化的影响因素
• 1.2.3.1 工程菌的的制备
• 1.2.3.2 外植体的选择
• 1.2.3.3 外植体的预培养、接种及与农杆菌的共培养
• 1.2.3.4 外植体脱菌与选择培养
• 1.3 农杆菌介导转化植物悬浮细胞研究
• 1.4 橡胶树遗传转化的研究进展
• 1.5 研究目的与意义
• 1.6 技术路线
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 农杆菌菌株与质粒
• 2.2 组织培养条件和试验所用重要试剂
• 2.2.1 组织培养条件
• 2.2.2 试验所用重要试剂
• 2.2.3 试验用培养基及其成分
• 2.3 根癌农杆菌介导转化橡胶树胚性细胞悬浮系研究
• 2.3.1 根癌农杆菌的培养
• 2.3.2 适宜抗生素浓度确定试验
• 2.3.2.1 胚性愈伤组织对不同抗生素浓度的敏感性试验
• 2.3.2.2 不同浓度的替卡西林对农杆菌的抑制作用
• 2.3.3 农杆菌介导转化橡胶树胚性悬浮细胞影响因素试验
• 2.3.3.1 农杆菌菌液浓度对转化效率的影响
• 2.3.3.2 共培养方式对转化效率的影响
• 2.3.3.3 共培养基pH值对转化效率的影响
• 2.3.3.4 共培养基中附加AS对转化效率的影响
• 2.3.3.5 共培养温度对转化效率的影响
• 2.3.3.6 共培养时间对转化效率的影响
• 2.3.4 GUS组织化学染色及FDA细胞活性测定
• 2.3.4.1 GUS组织化学染色
• 2.3.4.2 FDA细胞活性测定
• 2.3.5 试验数据统计与分析
• 2.3.6 抗性愈伤组织的筛选
• 2.3.7 抗性愈伤组织诱导体细胞胚与植株再生
• 2.4 拟转化植株的分子检测
• 2.4.1 橡胶树幼苗基因组DNA的提取
• 2.4.2 检测引物的设计
• 2.4.3 拟转化植株uidA和npt-Ⅱ基因的PCR检测
• 2.4.4 PCR产物的回收
• 2.4.5 PCR目的片段的克隆及其重组子筛选
• 2.4.5.1 连接反应
• 2.4.5.2 感受态E.coli JM109的制备
• 2.4.5.3 感受态鉴定
• 2.4.5.4 转化
• 2.4.5.5 阳性菌的PCR鉴定及克隆基因测序
• 2.4.6 橡胶树基因组DNA酶切
• 2.4.7 DNA杂交（Southern blotting）
• 2.4.7.1 杂交所需试剂准备
• 2.4.7.2 DNA的印迹转移
• 2.4.7.3 尼龙膜的固定
• 2.4.7.4 探针的制备
• 2.4.7.5 杂交
• 3 结果与分析
• 3.1 橡胶树胚性愈伤组织对不同浓度的抗生素敏感性试验
• 3.1.1 橡胶树胚性愈伤组织对不同替卡西林浓度的敏感性
• 3.1.2 橡胶树愈伤组织对不同卡那霉素浓度的敏感性试验
• 3.2 不同浓度的替卡西林对农杆菌的抑制效果
• 3.3 农杆菌介导转化橡胶树胚性悬浮细胞影响因素
• 3.3.1 农杆菌浓度对转化的影响
• 3.3.2 共培养方式对转化的影响
• 3.3.3 共培养基pH值对转化的影响
• 3.3.4 共培养AS浓度对转化的影响
• 3.3.5 共培养温度对转化的影响
• 3.3.6 共培养时间对转化的影响
• 3.4 抗性愈伤组织的筛选
• 3.5 抗性愈伤组织诱导胚状体及植株再生
• 3.6 抗性愈伤组织、胚状体及再生植株GUS组织化学染色检测
• 3.7 拟转化植株的分子检测
• 3.7.1 拟转化植株幼苗基因组DNA的提取
• 3.7.2 拟转化植株PCR检测
• 3.7.3 拟转化植株PCR产物测序分析
• 3.7.4 拟转化植株基因组DNA酶切
• 3.7.5 拟转化植株的npt-Ⅱ基因Southern杂交分析
• 4 讨论
• 4.1 转化的外植体选择
• 4.2 农杆菌介导转化橡胶树胚性悬浮细胞的主要影响因素
• 4.3 转化对再生植株的影响
• 5 结论
• 附表1
• 附表2
• 缩略词
• 参考文献
• 致谢