果胶酶基因片段的克隆及其表达载体构建

论文摘要

由细菌产生的果胶酶能广泛地应用于植物纤维脱胶、纺织业、咖啡和茶发酵、污水处理和造纸等方面。利用基因工程技术构建高产果胶酶的工程菌对相关工业的发展有着深远的意义。本实验研究了从枯草芽孢杆菌S-1（Bacillus subtilis S-1）和琼氏不动杆菌S-3（Acinetobacter junii S-3）两株菌的基因组中分别克隆到了一段果胶裂解酶基因片段pelB和一段未知基因片段,并对两者序列进行分析鉴定。另外,将pelB克隆到pET32a载体,构建表达载体,高效表达果胶酶,为酶制剂的生产奠定了基础。主要结论包括：1.利用PCR技术从B. subtilis S-1基因组DNA中扩增到基因片段pelB,将其插入到pMD20-T载体中,构建重组质粒pMD20-T-pelB,测序并构建进化树分析结果表明pelB基因片段为1,033bp,且pelB与来源于Bacillus sp果胶裂解酶pel-15和pelA的一致性分别为40.98%和39.20%；与Bacillus pumilus的pelB一致性为40.32%,综合结果初步表明pelB基因为果胶裂解酶基因。2.pelB拟表达蛋白质理化性质及结构的预测结果表明：拟表达蛋白质的分子式为C1671H2704N490O493S25,分子量为38,348.3Da,理论等电点为8.88,其N-末端为Gly,是亲水性不稳定蛋白,该片段中a-螺旋占25.3%、p-折叠占14.0%、无规则卷曲占60.7%。3.将pelB插入到pET32a载体中,构建表达型重组质粒pET32a-pelB,转化至感受态大肠杆菌BL21中,并经过IPTG诱导表达。经SDS-PAGE电泳分析表达的蛋白质的分子量约为40kD的表达蛋白。4从A.junii S-3基因组DNA中克隆出目的基因片段,测序并对序列分析：目的片段大小为917bp,该片段中含有一个747bp的开放阅读框,编码未知蛋白质。该蛋白质理化性质及结构的预测结果表明：拟表达蛋白质的分子式为C1223H1962N336O376S7,分子量为27,613.4Da,理论等电点为5.61,其N-末端为Met,是亲水性蛋白,该片段中a-螺旋占39.76%、β-折叠占18.88%、无规则卷曲占41.37%,信号锚定序列概率为11.7%,含有2个跨膜螺旋区。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 果胶质
• 1.2 细菌果胶酶主要产生菌
• 1.3 细菌果胶酶及其分类
• 1.4 细菌果胶酶的应用
• 1.4.1 植物纤维的脱胶
• 1.4.2 在纺织业方面的应用
• 1.4.3 在咖啡和茶发酵中的应用
• 1.4.4 在污水处理方面的应用
• 1.4.5 在造纸方面的应用
• 1.4.6 其他方面的应用
• 1.5 细菌果胶酶分子生物学研究进展
• 1.6 本课题的目的及研究意义
• 1.7 实验方案
• 第二章 果胶酶基因片段的克隆及鉴定
• 2.1 材料与试剂
• 2.1.1 菌株和载体
• 2.1.2 试剂盒与酶
• 2.1.3 常用试剂
• 2.1.4 主要仪器
• 2.1.5 主要培养基及试剂的配制
• 2.1.5.1 培养基
• 2.1.5.2 试剂的配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 培养条件
• 2.2.2 基因组DNA的提取
• 2.2.3 琼脂糖凝胶电泳检测
• 2.2.3.1 琼脂糖凝胶的制作
• 2.2.3.2 琼脂糖凝胶电泳
• 2.2.4 特异性引物的设计及PCR扩增
• 2.2.4.1 引物的设计
• 2.2.4.2 退火温度的初步优化
• 2.2.4.3 PCR扩增
• 2.2.5 PCR产物的回收
• 2.2.6 目的片段与pMD20-T载体的连接反应
• 2法）'>2.2.7 大肠杆菌JM109感受态细胞的制备（CaCl₂法）
• 2.2.8 转化
• 2.2.9 重组质粒的菌落PCR鉴定
• 2.2.10 重组质粒的提取
• 2.2.11 双酶切反应
• 2.3 结果与分析
• 第三章 目的基因片段的测序及分析
• 3.1 试验方法
• 3.1.1 目的基因的测序
• 3.1.2 序列分析
• 3.2 序列分析及拟表达蛋白预测结果
• 3.2.1 B-3菌中的目的片段pelB的测序及分析
• 3.2.1.1 B-3中目的片段pelB的测序结果
• 3.2.1.2 进化树构建
• 3.2.1.3 pelB的蛋白性质与结构预测
• 3.2.2 A-7菌中的目的片段测序及拟表达蛋白质结构测序
• 3.2.2.1 A-7中获得的目的片段的测序结果
• 3.2.2.2 氨基酸序列分析
• 第四章 pe/B基因的表达载体构建
• 4.1 材料
• 4.1.1 菌株与质粒
• 4.1.2. 主要试剂
• 4.1.3 主要实验仪器
• 4.1.4 主要试剂配制
• 4.2 方法
• 4.2.1 引物合成
• 4.2.2 PCR反应
• 4.2.3 PCR产物的回收
• 4.2.4 质粒pET32a的提取
• 4.2.5 双酶切反应
• 4.2.6 酶切产物回收
• 4.2.7 BL21感受态细胞的制备
• 4.2.8 连接反应
• 4.2.9 转化
• 4.2.10 鉴定
• 4.2.11 目的蛋白片段的诱导表达
• 4.2.12 SDS-PAGE电泳
• 4.3 结果
• 4.3.1 空载质粒pET32a和表达载体构建流程
• 4.3.2 PCR扩增
• 4.3.3 质粒pET32a和PCR产物的酶切反应
• 4.3.4 目的片段的诱导表达
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢