论文摘要
猴T淋巴细胞白血病毒I型（STLV-1）、猴单纯疱疹病毒（BV）在国内猴群中的感染率比较高,这不但影响动物健康和实验研究的结果,而且对实验接触人员具有严重危害性。目前,分离、细胞培养病毒作为抗原是诊断这两种疾病常用的方法,这对实验人员有严重的危害性,而且成本相对较高。为了获得更多的、对实验操作人员没有危害的抗原,本研究采用了体外化学合成猴T淋巴细胞白血病毒I型（STLV-1）gag、单纯疱疹病毒（BV）gd部分保守基因片段,经大肠杆菌的表达、亲和层析纯化,建立了STLV-1、BV的ELISA诊断方法,同时,建立了一种可以同时检测两种病毒抗体的液相芯片技术,这为以后的进一步实验奠定了基础。本研究根据Genbank公布序列化学合成STLV-1gag、BV gd基因片段,经酶切后将目的片段连接到表达载体pET15b中并进行测序鉴定。再将重组质粒转化到表达宿主菌BL21（DE3）中,经小量优化诱导表达条件后进行SDS-PAGE、Western Blot检测表达量及表达活性,经蛋白质活性鉴定及大小均正确的菌株进行大量（10L）发酵、纯化得到重组蛋白STLV-1 gag和重组蛋白BV gd。然后以重组蛋白作为抗原检测猴血清中相应抗体,并与现有商品化诊断试剂盒结果对比。同时,将重组蛋白STLV-1 gag、重组蛋白BV gd作为探针偶联到不同颜色（即不同编号）的荧光微球上对恒河猴血清中相应的抗体进行检测,检测结果与ELISA检测结果进行对比。经研究得到如下结果:1.从化学合成的pJ-STLV-1 gag、pJ-BV gd载体经酶切获得了目的片段STLV-1 gag （1323bp）, BV gd （1194bp）,然后将目的片段与表达载体pET15b连接,构建了重组表达质粒pET15b-STLV-1 gag、pET15b-BV gd。2.经鉴定正确的重组质粒转入表达宿主rosetta2 DE3 plysS中,小量诱导表达STLV-1 gag、BV gd,优化诱导表达条件后进行SDS-PAGE、Western Blot检测表达量及表达活性。结果表明,重组蛋白STLV-1 gag、重组蛋白BV gd在大肠杆菌中成功表达,STLV-1 gag重组蛋白以可溶形式存在于菌体中,BV gd重组蛋白以包涵体的形式存在。3.10L发酵罐大量诱导大肠杆菌表达重组蛋白STLV-1 gag和重组蛋白BV gd,然后经AKTA纯化系统Ni2+亲和层析纯化得到重组蛋白STLV-1 gag和重组蛋白BV gd。4.以重组蛋白STLV-1 gag为抗原检测广西某猴场1304份恒河猴血清,阳性率为3.76%,重组蛋白BV gd作为抗原检测514份恒河猴血清,阳性率为29.96%;现有商品化诊断试剂盒检出阳性率分别为2.68%、21.60%。经Western Blot确认检测结果,重组蛋白检出率明显高于现有商品化诊断试剂盒（P<0.05）。因此重组蛋白STLV-1 gag和重组蛋白BV gd可以作为病毒良好的代替抗原,解决了通过分离、培养病毒获取抗原的困难以及操作的危险性。同时,为猴群的净化、SPF实验用猴的保证提供了一种廉价、快速、准确、有效的ELISA诊断方法。5.对比ELISA与流式荧光微球检测结果,证明用荧光微球对猴血清进行检测,不仅比ELISA法快速省时,而且灵敏度比间接ELISA法高出5～100倍。建立了一种更为灵敏、方便快速、高通量的荧光微球诊断技术,在一个反应体系中可以同时检测多个指标,这与传统方法的逐个检测相比是一个质的飞跃。
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