论文摘要
研究背景：近年来,临床上对于口腔软组织缺损时多采用自体游离皮瓣、肌皮瓣、局部转移粘膜瓣等移植修复缺损,以保证移植物在口腔特殊环境中的成活；但这些方法的缺点也是不容忽视的：如移植后组织能否存活；组织量过大导致供区畸形；存活后的组织瓣保留供区的某些特性如毛发、汗腺等；二次创伤增加病人痛苦和病程等问题。随着组织工程学的发展,胶原膜因为其较好的生物相容性,可降解性,具有凝血作用,纤维网络结构有利于细胞的黏附等特点,且有研究对体外细胞在几种膜材料上的黏附、增殖和分化等进行比较,结果显示胶原膜的效果最好,胶原膜越来越被广泛应用。已经广泛地用作口腔软组织缺损的修复,取得了不同程度的效果。在组织工程和创伤修复中,新生血管是至关重要的一步。新生血管可以为创口及时地运送氧气和营养物质,利于创伤的修复。为了获得更好的软组织修复效果,研究者们尝试将各种细胞因子应用于软组织缺损的修复中,其中碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）是重要的血管生长因子之一。然而,由于单纯的bFGF应用在体内扩散太快,也容易被蛋白酶分解、半衰期短,因而不能在有效的时间内作用于更多的靶细胞,其生物学效能难以得到充分地发挥。学者们曾尝试通过提高bFGF的使用剂量来促进软组织的修复,然而,bFGF剂量太高,也会产生一系列的并发症,如血小板减少症,肾毒性,甚至激化某些潜在的恶性细胞等等。目前多将其与载体结合应用。而生长因子与载体材料的结合方式主要有两种,一种是靶向结合；另一种是物理简单吸附。靶向结合能限制生长因子的自由扩散,降低其使用剂量,达到高效率利用生长因子的目的。中国科学研究院Jianwu Dai等发现：将一段含七个氨基酸的寡肽即胶原结合域（collagen-binding domain, CBD）和bFGF的N端结合,形成具有与胶原靶向结合能力的CBD-bFGF;同时表达不带胶原结合域的天然bFGF,即NAT-bFGF。通过促进人成纤维细胞增殖的MTT分析实验检测其生物活性,结果提示CBD-bFGF与NAT-bFGF均有活性,两者生物活性相当。通过胶原铺底的ELISA法检测其胶原结合能力,结果提示CBD-bFGF有特异的胶原结合能力,其胶原结合能力高于NAT-bFGF。所以,目前研究的热点是将bFGF吸附、粘接、载负于载体上,建立稳定的bFGF释放系统,减少bFGF的使用剂量,减少bFGF的渗漏以提高植入位点局部的浓度,降低并发症的发生率,使其使用效能最优化。目的：鉴于以上问题和争议,本研究将低剂量的bFGF与胶原结合域结合形成具有胶原靶向结合能力的生长因子,再将其与胶原膜载体复合,形成稳定的缓慢释放系统,探讨其在大鼠硬腭软组织缺损模型中的修复作用,为有效的使用生长因子在软组织创面愈合中的作用提供理论依据及实践参考。方法：选用6周龄近交系SPF级雄性Wistar大鼠96只,体重约160-200g。将实验动物随机分成4组：A、B、C、D,每组24只动物。每只大鼠于硬腭部第一磨牙近中至第三磨牙远中的软组织中央用环形切龈钻作一直径为3mm的圆形缺损,A组植入结合bFGF/胶原膜；B组植入游离bFGF/胶原膜；C组植入胶原膜；D组不植入胶原膜（空白对照组）。分别于术后1、2、4、8周每组各处死动物6只。术后行大体观察、组织学、免疫组织化学观察,所有数据用SPSSl3.0分析软件进行处理。结果：1.实验动物术后生长恢复良好,无动物死亡,手术创口无炎症感染,均达到Ⅰ期愈合,胶原膜无排斥反应。实验观察期间术区无明显红肿、无化脓。2.术后3天见胶原膜呈淡黄色,紧贴骨面,未降解。1周时部分缝线脱落,四组创面均未完全愈合,创缘无明显红肿,无异常渗出液,胶原膜部分降解呈淡黄色。2周时,四组创面均完全愈合,肉眼观察无差异。4周和8周时四组创面完全愈合。3.HE染色可观察上皮层形成情况,成纤维细胞,炎症细胞,新生血管,胶原膜等。1周时,可见四组上皮层未完全形成,结合bFGF/胶原膜组、游离bFGF/胶原膜组、胶原膜组可见部分未降解的胶原膜,结合bFGF/胶原膜组新生血管,成纤维细胞和炎症细胞较其他三组多,且血管管腔较大。2周时,可见四组上皮层形成,结合bFGF/胶原膜组、游离bFGF/胶原膜组、胶原膜组可见胶原膜大部分吸收,结构不清。结合bFGF/胶原膜组上皮层形成,上皮钉突粗大,大量新生血管形成,管腔较大；游离bFGF/胶原膜组和胶原膜组上皮层层次清晰,少量上皮钉突形成,较多新生血管形成；空白对照组上皮层形成,无明显上皮钉突形成,较少新生血管形成。4、8周时,胶原膜完全吸收,各组上皮层均形成,上皮钉突明显。4.统计学分析结果：（1）上皮组织两端间的距离分析：1周时各处理组间进行单因素方差分析,结合bFGF/胶原膜组,游离bFGF/胶原膜组,胶原膜组,空白对照组上皮组织两端间的距离差异具有统计学意义（F=18.904,<0.001）。即上皮组织两端间的距离结合bFGF/胶原膜组最短,空白对照组最长,游离bFGF/胶原膜组和胶原膜组相当,居中。（2）创面愈合率分析：1周时各处理组间进行单因素方差分析,结合bFGF/胶原膜组,游离bFGF/胶原膜组,胶原膜组,空白对照组创面愈合率差异具有统计学意义（F=18.904,P<0.001）。即创面愈合率结合bFGF/胶原膜组最大,空白对照组最小,游离bFGF/胶原膜组和胶原膜组相当,居中。（3）新生血管数目分析：经析因方差分析,结果显示不同时间段间新生血管数目差异有统计学意义（F=161.167,P<0.001）；不同处理组间新生血管数目差异有统计学意义（F=114.871,P<0.001）。不同时间段和不同处理组两因素间有交互作用（F=17.792,P<0.001）。故分别于每一时间段对四个处理组的新生血管数目进行单因素方差分析比较。1、2和4周时四组新生血管数目差异有统计学意义（P<0.001）,结合bFGF/胶原膜组在各个时间段的血管数目都是最多的,其次是游离bFGF/胶原膜组和胶原膜组,空白对照组新生血管数目最少。8周时,四组新生血管数目差异无统计学意义（P=0.782）。从1周到8周,各组新生血管数目均先增多再减少,2周时达到高峰,后又逐渐减少。（4）肌成纤维细胞平均光密度值分析：经析因方差分析,结果显示不同时间段间差异有统计学意义（F=939.366,P<0.001）；不同处理组间差异有统计学意义（F=90.683,P<0.001）。不同时间段和不同处理组两因素间有交互作用（F=11.969,P<0.001）。故分别于每一时间段的四个处理组进行单因素方差分析比较。1、2和4周时四组肌成纤维细胞平均光密度值差异有统计学意义（P<0.001）,结合bFGF/胶原膜组在各个时间段的肌成纤维细胞平均光密度值都是最低的,其次是游离bFGF/胶原膜组,胶原膜组和空白对照组是最高的。8周时,四组肌成纤维细胞平均光密度值差异无统计学意义（P=0.392）。从1周到8周,各组肌成纤维细胞平均光密度值均先增加再减少,2周时达到高峰,后又逐渐减少。结论：1.将胶原结合域与bFGF结合形成具有与胶原靶向结合能力的bFGF,再将其复合到胶原膜后,形成了缓释系统持续释放bFGF,有更好的促血管新生作用,组织修复获得良好的血管化情况,利于软组织缺损的再生重建。2.结合bFGF/胶原膜促进大鼠口腔软组织缺损的修复,加快创面愈合。3.结合bFGF/胶原膜在软组织缺损愈合过程中,肌成纤维细胞平均光密度值最低,肌成纤维细胞含量最少,能减少组织愈合过程中的创面收缩,改善创面愈合质量。
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标签：碱性成纤维细胞生长因子论文; 胶原膜论文; 软组织缺损论文; 新生血管论文; 肌成纤维细胞论文;