一、截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白反式激活作用的初步研究（论文文献综述）
杨易,苏何玲[1]（2014）在《乙肝病毒截短型中蛋白反式调节作用的研究进展》文中研究说明HBV编码的反式激活蛋白可能是HBV致癌的主要因素之一。研究证实乙型肝炎病毒表面抗原羧基末端截短型中蛋白（MHBst）是一种具有反式激活作用的蛋白质分子,可调节原癌基因、端粒酶及一氧化氮合酶的表达,影响磷脂代谢并与胰岛素抵抗相关。现就MHBst的研究进展进行综述。
周飞[2]（2011）在《乙型肝炎病毒感染肝细胞癌患者中截短型中蛋白的研究》文中认为目的:分子流行病学方法检测肝癌患者中HBV病毒株MHBst的种类,并研究各种MHBst的反式激活能力及对细胞的增殖、成瘤和凋亡影响。以免疫沉淀的方法筛选MHBst167候选结合蛋白。探讨截短中蛋白在肝细胞内的可能存在的分子作用机制。方法:应用多聚酶链反应（PCR）和Alu-PCR技术自HBV感染肝癌患者外周血和肝癌组织中扩增S基因序列,并进行pMD18-T载体的TA克隆,随机选择部分克隆进行DNA测序并对测序结果进行生物信息学分析。应用GeneTailor Site-Directed Mutagenesis System突变S蛋白的起始密码子,将S基因点突变成功的不同MHBst构建真核表达载体和腺病毒表达载体,转染或感染细胞后Western-blot验证其蛋白的表达。通过启动子激活萤火虫萤光素酶的表达研究不同MHBst反式激活功能。通过CCK-8、软琼脂克隆形成及TUNEL方法观察不同截短型的中蛋白对细胞增殖、成瘤及凋亡功能的影响。以免疫沉淀的方法筛选出MHBst167结合蛋白。结果:成功自80例HBV感染肝癌患者的血清中获得700多个S基因的阳性克隆,通过测序获得600条S区基因序列,发现7种分别在77,90,116,124,129,227,254处氨基酸终止编码的MHBst;其中129,227,254三种MHBst出现的频率较高,分别为15%（12/80）,7.5%（6/80）和20%（16/80）;12例MHBst129全为C基因型,6例MHBst227只有1例为B基因型,其余为C基因型,而16例254只有1例为C基因型,其余均为B基因型。Alu-PCR从30例肝癌标本中检测出3例标本有S基因的整合,共发现了9种整合位点。对8种不同MHBst和完整中蛋白成功进行了小蛋白起始密码子的突变。构建了8种不同MHBst和完整中蛋白的pCDNA3.1、p3xflag-cmv-10真核表达载体,并成功获得MOI值分别为:Ad-77:160,Ad-90:320,Ad-116:320,Ad-124:320,Ad-129:320,Ad-227:500,Ad-254:320,Ad-167:160,Ad-281:160,Ad-GFP:320的病毒液。获得了能够分别表达SV40、c-fos、c-myc启动子的细胞株。不同MHBst的反式激活能力、增殖及克隆形成能力不同。MHBst167可以通过TRAIL诱导产生细胞凋亡并可以被阻断剂PD98059。免疫沉淀方法获得了相互作用蛋白醛缩酶B。结论:HBV感染肝癌患者血清中存在7种不同类型MHBst,以C基因型出现的种类比较多。HBV感染肝癌患者发生S基因整合较少,且为随机整合,但其整合可能涉及细胞的增殖、凋亡等生物学功能。不同类型的MHBst有反式激活能力,并对细胞的增殖及凋亡的有一定影响。免疫沉淀筛选出了醛缩酶B可与MHBst167蛋白相互作用,为下一步研究提供新的线索。
田江克[3]（2007）在《乙型肝炎病毒截短型表面抗原中蛋白结合蛋白基因的筛选研究》文中认为乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是严重影响我国人民健康的重要传染病，可引起急、慢性病毒性肝炎，导致肝纤维化（LC），甚至肝细胞癌（HCC）。HBV感染致肝细胞损伤机制，很大程度上与病毒蛋白和宿主细胞蛋白间的相互作用相关。因此，研究HBV抗原成分与宿主细胞蛋白相互作用及其机理能在一定程度上对HBV的致病机制做出解释，为寻找有效防治HBV的方法提供新线索。HBV基因组具有4个主要的开放读码框架（ORF），分别命名为S、C、P、X区，其中S区通过三个框架（in-frame）内起始密码子（ATG）分为三个结构域：前-S1，前-S2和S结构域，由此3个ATG开始编码产生3种大小不同的表面抗原蛋白：主蛋白（SHBs），中蛋白（MHBs．前-S2+S）和大蛋白（LHBs：前-S1+前-S2+S）。完整的MHBs多肽链是由55个aa的PreS2区和226个aa的S区组成的，研究表明，羧基末端截短形式的HBV表面抗原中蛋白（MHBst）具有反式调节功能，在HBV致病（癌）过程中发挥着重要的作用，但MHBst与宿主细胞的结合蛋白目前还不十分清楚。为研究羧基末端截短形式的HBV表面抗原中蛋白的结合蛋白，本实验应用酵母双杂交技术筛选表达型cDNA白细胞文库中与MHBst的结合蛋白的基因。酵母双杂交是一种研究蛋白-蛋白间相互作用的比较快速、可靠并可大规模筛选的技术。本实验采用酵母双杂交系统-3，利用两种单倍体酵母a和α接合型可以配合形成二倍体，而其中表达的外源蛋白仍能相互作用，免去了低效率文库质粒与诱饵质粒共转染的问题，大大提高了杂交效率；在原技术基础上增加了3个报告基因，降低了假阳性率，保证实验结果的真阳性率达95％。我们首先利用多聚酶链反应（PCR）方法扩增羧基末端167位aa截短的HBV表面抗原中蛋白的基因编码序列，经酶切鉴定正确并连接入酵母表达载体pGBKT7中构建“诱饵”质粒，转化酵母细胞AH109（a型）并在其内表达，Western-blotting验证。然后与转化了人白细胞cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187（α型）进行配合。结果成功克隆出MHBst蛋白并在酵母细胞中表达，配合后选出既能在四缺（SD／-Trp-Leu-Ade-His）培养基又能在铺有X-α-半乳糖（X-α-gal）的四缺培养基上生长并变成蓝色的菌落10个。提取阳性酵母菌落的质粒，电穿孔法转化大肠杆菌，接种在氨苄青霉素-LB平板上选择并测序，经生物信息学分析，排除读码框架不正确者，最后得到9种已知基因，ADP核糖基因子2个，RAB6相互作用蛋白1个，CCR4-NOT转录复合体亚基10（CCR4-NOT-10）1个，脂多糖蛋白结合蛋白（LBP）1个，醛缩酶B（ALDOB）1个，补体成分3（C3）1个，丙酮酸脱氢酶（PDH）1个，人类细菌人工染色体（BAC）1个。为进一步确证经酵母双杂交技术筛选出的结合蛋白与诱饵蛋白间在体外也有相互作用，我们扩增出脂多糖结合蛋白（LBP）基因并克隆入酵母表达载体pGADT7，在TNT网织红细胞裂解物体外翻译，掺入同位素35S，与相应的“诱饵”蛋白进行体外免疫共沉淀反应，进一步证实LBP可以与MHBst特异性结合。本研究成功克隆出MHBst结合蛋白，为进一步研究其在HBV感染中的作用提供了新线索。
刘妍,成军,徐东平,戴久增,韩萍,陆荫英[4]（2007）在《羧基末端截短的HBV表面抗原中蛋白反式激活c-myc表达》文中研究表明目的构建羧基末端截短的乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白（MHBst）反式激活基因的消减文库,并观察其对细胞原癌基因c-myc的反式激活作用。方法以重组表达质粒pcDNA3.1（-）-MHBst和空载体pcDNA3.1（-）瞬时转染HepG2细胞,提取细胞mRNA并逆转录为cDNA,分别标记为实验组与对照组,应用抑制性消减杂交技术,构建MHBst反式激活的cDNA消减文库。针对其中的原癌基因c-myc,进一步克隆其启动子序列并构建报告基因表达载体pCAT3-c-myc,与pcDNA3.1（-）-MHBst共转染HepG2细胞,ELISA法检测报告基因氯霉素乙酰转移酶CAT的表达活性。同时,应用反转录聚合酶链反应和免疫印迹方法检测表达MHBst的细胞中c-myc基因的mRNA转录和蛋白表达水平。结果随机挑选消减文库中的50个阳性克隆进行测序和生物信息学分析,显示19种已知功能基因,涉及细胞代谢、信号转导、细胞凋亡和肿瘤发生等生物学过程。细胞内瞬时表达的MHBst蛋白能够反式激活细胞原癌基因c-myc启动子的转录活性,并且RT-PCR和Western blotting结果也证明了表达MHBst蛋白的细胞中原癌基因c-myc的表达水平明显增强。结论成功构建MHBst反式激活基因的消减文库,MHBst可以反式激活细胞原癌基因c-myc的表达,为深入了解乙型肝炎病毒致癌的分子生物学机制提供理论基础。
李志群,成军,马英骥[5]（2005）在《乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白结合蛋白研究进展》文中提出目前对乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的急性、慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌的治疗,还没有理想的疗效.利用新型技术对HBV感染肝细胞的相关受体蛋白进行研究,即对HBV表面抗原中蛋白结合蛋白进行筛选是一个重要的研究方向.HBV进入肝细胞之后,其基因组在肝细胞内具有顺式和反式两种调控方式.HBV蛋白对肝细胞基因组的反式调节作用影响了肝细胞的基因表达谱,从而对肝细胞的生长、代谢及恶性转化产生重要影响.研究羧基末端截短的表面抗原中蛋白的结合蛋白可能是阐明HBV感染慢性化及引起肝细胞癌的重要分子生物学机制之一.
刘华[6]（2005）在《乙肝病毒羧基末端截短的preS2/S编码蛋白（MHBst）对端粒酶逆转录酶启动子反式激活作用的初步研究》文中研究指明目的: 分别构建HBV截短型中蛋白（MHBst）真核表达载体与带有端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子和荧光素酶的报告基因质粒,利用体外共转染实验,转入端粒酶表型不同、处于不同分化阶段的多种细胞中,通过检测荧光素酶活性,探讨MHBst对hTERT启动子的调控作用,为揭示HBV相关性疾病的发生机制提供新思路。 方法: 1.乙肝病毒截短型中蛋白在肝癌细胞中的表达及其反式激活作用研究 设计引物,PCR扩增两条长度不同的HBV截短型中蛋白基因片段,分别定向克隆入真核表达载体pcDNA3,构建重组表达质粒pcS2与pcTS。重组子经PCR及测序鉴定。将重组子与报告质粒pGL3-control共转染肝癌细胞系HepG2,检测荧光素酶表达强度,以验证所构建的HBV截短型中蛋白表达载体在体外的反式激活作用。为进一步研究HBV截短型中蛋白及编码基因片段对肝癌细胞的影响,将重组质粒pcS2和pcTS分别转染肝癌细胞系HepG2,经G418筛选,获得阳性细胞,通过生长曲线与集落形成试验研究MHBst对肝癌细胞的生物学特性的影响。 2.端粒酶逆转录酶启动子报告基因质粒 分别用双酶切和PCR方法从pCR-TRTP载体上获得全长hTERT启动子基因序列TRTP与5’端缺失hTERT启动子基因序列Del445（包含有HBV同源序列）,分别克隆到pGL3-basic多克隆位点上,构建真核表达载体pGL3-TRTP, pGL3-del445。重组子经酶切、PCR及测序鉴定。将重组子pGL3-TRTP/pGL3-del445分别与pRL-tk共转染不同细胞系HELF、LO2、Bel7402,通过检测荧光素酶表达强度,评估报告基因质粒中端粒酶启动子活性。 3.MHBst对hTERT启动子的调控作用
纪冬,成军,董菁,刘妍,王建军,郭江[7]（2004）在《应用基因表达谱芯片技术筛选HBV前-S2蛋白反式调节基因》文中进行了进一步梳理目的:乙型肝炎病毒（HBV）前-S2蛋白是由HBV S基因编码的具有多种功能的蛋白质.前-S2蛋白的表达对于HBV感染肝细胞的基因表达谱具有显着影响.为了研究前-S2蛋白反式调节的靶基因,我们应用基因芯片技术对于pcDNA3.1 （-）和pcDNA3.1（-）-preS2分别转染的HepG2细胞的基因表达谱进行分析. 方法:以含有HBV全基因组的质粒G376-7（GenBank号: AF384371）作为模板,应用聚合酶链反应（PCR）技术扩增前-S2蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术构建表达载体pcDNA3.1（-）-preS2.以脂质体技术转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取总mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1（-）的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较. 结果:构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA事列测定,证实准确无误,提取高质量的总mRNA并进行逆转录成为cDNA,进行DNA芯片技术分析.在1 152个基因表达谱的筛选中,发现有42个基因表达水平显着上调,36个基因表达水平显着下调. 结论:HBV的前-S2蛋白是一种反式激活因子,前-S2基因的表达对于肝细胞基因表达谱有显着影响.
董菁,成军,杨倩[8]（2004）在《乙型肝炎病毒新开放读码框架的确定及其意义》文中进行了进一步梳理乙型肝炎病毒（HBV）是一种嗜肝部分双链DNA病毒,基因组长度只有3.2 kb,结构基因与调节基因序列之间重叠, 甚至结构基因序列之间重叠,因此HBV DNA序列的利用率之高实属罕见.1979年首次报告HBV DNA的全基因序列并确定4个主要的开放读码框架（ORF）之后,一直沿用至今. 我们在中国流行株HBV基因序列的分析中,在前-Sl和X 基因之前,分别发现了2段编码基因序列:前-前-S基因长度135 bp,编码产物为45 aa;前-X基因长度168 bp, 编码产物为56 aa.在前-前-S基因、前-X基因的上游存在启动子序列,具有指导报告基因表达的活性.对15例慢性乙型肝炎（CHB）患者基因型C型9例、B型1例、B/C混合型5例,共31个克隆测序结果,发现均存在前-前-S基因区.17例CHB患者A型1例、B型3例、C型10例、B/ C混合型3例,共测序45个克隆,C型编码前-X区的克隆数占总编码克隆数的60%,C型不能编码前-X区的原因主要是A2608→C/T替换突变或C/A2733→T替换突变单一突变;而B型、B/C型都不能编码前-X区蛋白,主要因为双突变的存在.在HBV基因组中发现前-前-S和前-X基因序列的存在改写了HBV DNA编码基因序列研究的历史.
成军,李克,刘妍,王琳,陆荫英,钟彦伟[9]（2004）在《HCBP6对HCV核心蛋白反式激活作用的影响》文中进行了进一步梳理目的:研究HCBP6蛋白在细胞内表达时,是否通过蛋白- 蛋白之间的相互作用,对HCV核心蛋白的反式激活作用产生影响. 方法:利用常规的分子生物学技术分别构建HCBP6蛋白和丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白的真核表达载体.酶联免疫黏附法enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测CAT的表达水平,间接测定HCV核心蛋白对于SV40病毒即刻早期启动子的反式激活活性. 结果:重组表达载体pcDNA3.1（-）-HCBP6、pcDNA3.1（-）- core经过限制性内切酶作图分析和核苷酸序列分析证实正确无误.转染HepG2细胞之后,HCV核心蛋白的表达,对于SV40病毒即刻早期启动子的转录表达活性具有显着的反式激活作用.但是,当与HCBP6蛋白的表达载体进行共转染时,SV40病毒的即刻早期启动子的转录活性受到抑制.重复试验得到了相似的结果.HCBP6蛋白的表达对于HCV反式激活SV40病毒即刻早期启动转录活性的抑制率40.4-62.3%. 结论:HCBP6蛋白在细胞内的表达对HCV核心蛋白反式激活SV40病毒的即刻早期启动子的转录活性具有显着的抑制作用.
纪冬,成军,郭江,王建军,刘妍,杨倩,王春花,党晓燕[10]（2004）在《乙型肝炎病毒前-S1蛋白反式激活蛋白l基因的克隆化研究》文中提出目的 应用抑制性消减杂交 （SSH）技术及生物信息学 （bioinformatics）技术筛选并克隆乙型肝炎病毒 （HBV）前 S1蛋白（pre S1）反式激活新型靶基因 ,进一步阐明HBV感染相关性疾病的发病机制。方法 以HBV前 S1蛋白表达质粒pcDNA3 .1（-） PreSl转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 .1（-）为平行对照 ,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。并应用分子生物学技术 ,结合生物信息学技术 ,克隆HBV前 Sl反式激活作用的新的靶基因。结果 对于所获基因片段序列分析表明 ,其中之一为新型基因片段。从HepG2细胞提取总RNA ,以逆转录多聚酶链反应 （RT PCR）技术扩增获得该新基因的全长序列 ,并测序证实 ,因其可以被前 S1蛋白反式激活 ,故命名为前Sl反式激活蛋白 1（PSlTPl） ,已在GenBank中注册 ,注册号 :AY42 6672。PSlTPl基因的编码序列全长为64 2个核苷酸 （nt） ,编码产物由 2 13个氨基酸残基 （aa）组成。结论 HBV前 Sl蛋白在HBV进入宿主细胞的过程中起着重要的作用 ,最近的研究表明前 Sl蛋白还具有反式激活的作用 ,上调宿主细胞某些基因的表达 ,从而改变宿主正常的应答水平 ,引起病变。HBV前 Sl反式激活新靶基因的发现 ,为进一步研究HBV前 Sl蛋白的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础
二、截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白反式激活作用的初步研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白反式激活作用的初步研究（论文提纲范文）
（1）乙肝病毒截短型中蛋白反式调节作用的研究进展（论文提纲范文）
| 1 MHBst的结构特点 |
| 2 MHBst反式激活机制 |
| 3 MHBst反式激活原癌基因的表达 |
| 4 MHBst的反式激活与磷脂代谢 |
| 5 MHBst的反式激活与胰岛素抵抗 |
| 6 MHBst的反式激活与端粒酶 |
| 7 MHBst调节一氧化氮合酶基因的表达 |
（2）乙型肝炎病毒感染肝细胞癌患者中截短型中蛋白的研究（论文提纲范文）
| 主要英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 主要材料、器材、配方、操作方法 |
| 1. 主要材料 |
| 2. 主要仪器 |
| 3. 主要试剂及配方 |
| 前言 |
| 第一部分 |
| 肝癌患者血清中乙型肝炎病毒MHBst的筛选 |
| 肝癌组织中乙型肝炎病毒MHBst的筛选 |
| 结论 |
| 第二部分 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 结论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文 |
（3）乙型肝炎病毒截短型表面抗原中蛋白结合蛋白基因的筛选研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 仪器设备 |
| 第一部分 |
| 前言 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 |
| 前言 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 |
| 前言 |
| 1 己知基因的克隆化鉴定 |
| 2 体外翻译 |
| 3 体外免疫共沉淀 |
| 4 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述一 |
| 综述二 |
| 论着 |
| 致谢 |
（4）羧基末端截短的HBV表面抗原中蛋白反式激活c-myc表达（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 消减文库的产生及分析: |
| 1.2.2 报告质粒的构建及CAT酶活性检测: |
| 1.2.3 RT-PCR检测c-myc mRNA表达: |
| 1.2.4 Western blotting分析c-myc |
| 2 结果 |
| 2.1 MHBst反式激活基因消减文库分析结果 |
| 2.2 MHBst反式激活细胞原癌基因c-myc启动子转录活性 |
| 2.3 MHBst反式激活细胞原癌基因c-myc mRNA表达 |
| 2.4 MHBst反式激活细胞原癌基因c-myc蛋白 |
| 3 讨论 |
（6）乙肝病毒羧基末端截短的preS2/S编码蛋白（MHBst）对端粒酶逆转录酶启动子反式激活作用的初步研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 构建具有反式激活作用的HBV截短型中蛋白真核表达载体 |
| 技术路线 |
| 1 材料 |
| 1.1 质粒与菌种 |
| 1.2 细胞 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 试剂盒 |
| 1.5 DNA分子量marker |
| 1.6 PCR引物 |
| 1.7 一般试剂 |
| 1.8 主要实验仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 重组子的构建 |
| 2.1.1 质粒DNA的制备 |
| 2.1.2 目的基因片断的获得 |
| 2.1.3 质粒pcDNA3的酶切线性化与回收 |
| 2.1.4 目的基因片断与载体的连接 |
| 2.1.5 连接产物的转化 |
| 2.1.6 阳性重组子pcS2与pcTS的筛选鉴定 |
| 2.1.7 阳性克隆的保存 |
| 2.2 乙肝病毒截短型中蛋白表达载体反式激活作用的研究 |
| 2.2.1 QIAprep Spin minprep试剂盒抽取与纯化质粒DNA |
| 2.2.2 HepG2细胞培养 |
| 2.2.3 脂质体转染 |
| 2.2.4 细胞的收集与裂解 |
| 2.2.5 荧光素酶表达量的测定 |
| 2.3 稳定表达的乙肝病毒截短型中蛋白对肝癌生物学特性的影响 |
| 2.3.1 脂质体介导HBV截短中蛋白表达载体转染肝癌细胞HepG2 |
| 2.3.2 阳性克隆的稳定筛选 |
| 2.3.3 RT-PCR检测HBV截短中蛋白mRNA的表达 |
| 2.3.4 冻存稳定筛选的阳性克隆细胞 |
| 2.3.5 生长曲线的测定 |
| 2.3.6 软琼脂集落形成实验 |
| 3 结果 |
| 3.1.重组子的构 |
| 3.1.1 质粒的获得 |
| 3.1.2 PCR扩增目的基因片断 |
| 3.1.3 目的基因片断和载体的酶切回收 |
| 3.1.4 阳性重组子鉴定 |
| 3.2.乙肝病毒截短型中蛋白的反式激活作用 |
| 3.2.1 脂质体转染 |
| 3.2.2.乙肝病毒截短型中蛋白对SV40启动子／增强子有反式激活作用 |
| 3.3.乙肝病毒截短型中蛋白对肝癌细胞生物学特性的影响 |
| 3.3.1 阳性克隆的稳定筛选 |
| 3.3.2 RT-PCR检测HBV截短中蛋白mRNA的表达 |
| 3.3.3 稳定表达的截短型中蛋白抑制肝癌细胞的生长 |
| 3.3.4 稳定表达的截短型中蛋白抑制肝癌细胞的集落形成能力 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 构建端粒酶逆转录酶启动子报告质粒 |
| 技术路线 |
| 1 材料 |
| 1.1 质粒 |
| 1.2 细胞 |
| 1.3 引物 |
| 1.4 主要试剂 |
| 2 方法 |
| 2.1 重组子pGL3-TRTP的构建 |
| 2.1.1 质粒pCR—TRTP，pGL3-basic的酶切鉴定 |
| 2.1.2 目的片断TRTP的获取 |
| 2.1.3 载体pGL3-basic线性化 |
| 2.1.4 目的片断TRTP与载体pGL3-basic的回收与纯化 |
| 2.1.5 目的基因TRTP与载体的连接 |
| 2.1.6 重组质粒pGL3-TRTP的转化 |
| 2.1.7 阳性克隆株pGL3-TRTP的鉴定 |
| 2.2 重组子pGL3-del445的构建 |
| 2.2.1 目的片断Del445的获取 |
| 2.2.2 质粒pGL3-basic的酶切线性化 |
| 2.2.3 目的基因Del445与载体pGL3-basic的连接 |
| 2.2.4 重组质粒pGL3-del445的转化 |
| 2.2.5 阳性重组子pGL3-del445的筛选鉴定 |
| 2.3 hTERT启动子活性的验证 |
| 2.3.1 原代细胞的培养 |
| 2.3.2 RT-PCR检测不同细胞系hTERT的表达 |
| 2.3.3 hTERT启动子活性的鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1.重组子的构建 |
| 3.1.1 质粒pCR-TRTP、pGL3-basic的鉴定 |
| 3.1.2 目的基因片断的获得 |
| 3.1.3 目的基因片断与载体的酶切回收 |
| 3.1.4 阳性重组子pGL3-TRTP、pGL3-del445的酶切筛选 |
| 3.1.5 DNA测序及序列分析 |
| 3.2.hTERT启动子活性的验证 |
| 3.2.1 原代细胞HELF的培养 |
| 3.2.2.不同细胞hTERT的表达 |
| 3.2.3.hTERT启动子在不同细胞系中的活性 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 MHBst对hTERT启动子的反式激活作用的研究 |
| 技术路线 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 2.1 不同细胞hTERT的扩增 |
| 2.2 共转染实验 |
| 2.3 细胞的收集与荧光素酶表达量的测定 |
| 2.4 反义寡核苷酸封闭MHBst表达的最佳量 |
| 2.4.1 脂质体转染 |
| 2.4.2 抽提RNA |
| 2.4.3 逆转录扩增实验 |
| 2.4.4 HBV截短中蛋白的PCR扩增 |
| 2.5 反义封闭 |
| 2.6 反义封闭后荧光素酶表达量的测定 |
| 3 结果 |
| 3.1 不同细胞hTERT的表达 |
| 3.2 HBV截短中蛋白对hTERT启动子的反式激活作用 |
| 3.2.1 共转染验证其反式激活作用 |
| 3.2.2 最佳反义寡核苷酸浓度 |
| 3.2.3 特异性反式激活作用的验证 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 拟进展计划 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 第一部分附图 |
| 第二部分附图 |
| 第三部分附图 |
| 附录 质粒物理图谱 |
| 致谢 |
| 发表论文及论着目录 |
（7）应用基因表达谱芯片技术筛选HBV前-S2蛋白反式调节基因（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1材料 |
| 1.2方法 |
| 1.2.1真核表达载体的构建及细胞转染 |
| 1.2.2基因表达谱芯片检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 总RNA及mRNA的定性、定量分析 |
| 2.2 HBV前-S2蛋白反式调节基因 |
| 3 讨论 |
（10）乙型肝炎病毒前-S1蛋白反式激活蛋白l基因的克隆化研究（论文提纲范文）
| 材料与方法 |
| 一、主要实验材料和试剂 |
| 二、消减杂交文库的建立及克隆分析 |
| 三、新基因的PCR扩增与序列分析 |
| 结 果 |
| 一、mRNA的定性、定量分析 |
| 二、消减杂交文库的构建与分析 |
| 三、新基因的序列分析及全长基因的获得 |
| 讨 论 |
四、截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白反式激活作用的初步研究（论文参考文献）
- [1]乙肝病毒截短型中蛋白反式调节作用的研究进展[J]. 杨易,苏何玲. 华夏医学, 2014(06)
- [2]乙型肝炎病毒感染肝细胞癌患者中截短型中蛋白的研究[D]. 周飞. 福建医科大学, 2011(09)
- [3]乙型肝炎病毒截短型表面抗原中蛋白结合蛋白基因的筛选研究[D]. 田江克. 中国人民解放军军事医学科学院, 2007(04)
- [4]羧基末端截短的HBV表面抗原中蛋白反式激活c-myc表达[J]. 刘妍,成军,徐东平,戴久增,韩萍,陆荫英. 胃肠病学和肝病学杂志, 2007(01)
- [5]乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白结合蛋白研究进展[J]. 李志群,成军,马英骥. 世界华人消化杂志, 2005(16)
- [6]乙肝病毒羧基末端截短的preS2/S编码蛋白（MHBst）对端粒酶逆转录酶启动子反式激活作用的初步研究[D]. 刘华. 山东大学, 2005(08)
- [7]应用基因表达谱芯片技术筛选HBV前-S2蛋白反式调节基因[J]. 纪冬,成军,董菁,刘妍,王建军,郭江. 世界华人消化杂志, 2004(07)
- [8]乙型肝炎病毒新开放读码框架的确定及其意义[J]. 董菁,成军,杨倩. 世界华人消化杂志, 2004(04)
- [9]HCBP6对HCV核心蛋白反式激活作用的影响[J]. 成军,李克,刘妍,王琳,陆荫英,钟彦伟. 世界华人消化杂志, 2004(04)
- [10]乙型肝炎病毒前-S1蛋白反式激活蛋白l基因的克隆化研究[J]. 纪冬,成军,郭江,王建军,刘妍,杨倩,王春花,党晓燕. 胃肠病学和肝病学杂志, 2004(01)