超嗜热酯酶APE1547突变体的结构和酶学性质的研究

论文摘要

本实验室已经成功地在大肠杆菌中克隆表达了超嗜热酯酶APE1547 基因,本文的研究对象即是以此为模板应用定向进化方法建立突变库并经筛选得到的突变体。该突变体的立体选择性比野生型提高了2.26 倍。本文对该突变体的结构、表达和分离纯化以及酶学性质和稳定性进行了研究。研究发现,突变体的五个突变位点分别处于距离酶的活性部位中等或较远的位置。通过三维结构的模拟发现突变体酶锚定于C端结构域的N 末端手臂结构的起始端的结构发生了折叠上的变化。在对突变体的表达和分离纯化中,发现突变体酶的表达量比野生型提高了50%。这个提高估计是由于稀有密码子的突变所引起。对突变体酶的基本酶学性质的研究表明:突变体的最适反应温度为85℃,最适pH 为8.0,它的pH 适用范围变窄,在碱性溶液中催化能力下降。从底物特异性来看,突变体与野生型一致。大多数金属离子对两种酶都没有明显的激活或抑制作用。极性表面活性剂完全抑制了突变体的酶活性,而非极性表面活性剂对野生型和突变体都略有激活作用。本文还通过对酶分子在不同温度下构象变化行为对活力和稳定性的影响的比较,对突变体的热稳定性和pH 稳定性进行了研究。结果表明突变体酶的热稳定性下降,pH 稳定性向低pH 值略有移动。上述结果说明,五个位点的氨基酸发生突变之后,整个酶分子结构发生了一定的变化。这些突变引起了酶分子表面的电荷变减少,接触溶剂表面的减少和“松散末端”(如N 端,C 端)锚定于蛋白质表面作用的减弱等变化,从而使酶分子结构的刚性减弱。

论文目录

• 第一章 前言
• 1.1 研究嗜热酶的意义
• 1.2 嗜热酶的结构特点和稳定性机制
• 1.2.1 嗜热酶的结构特点
• 1.2.2 嗜热酶的稳定性机制
• 1.3 酯酶的定向进化
• 1.4 定向进化在酶制剂改造在的应用
• 1.5 本文的研究背景和立论依据
• 1.6 本课题的意义
• 1.7 参考文献
• 第二章 突变体的结构分析
• 2.1 引言
• 2.2 实验菌株
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 突变库的构建和筛选方法的建立
• 2.3.2 目的基因的序列测定
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 突变库的构建和筛选结果
• 2.4.2 DNA 测序结果和催化机制的分析
• 2.4.3 突变体三维结构的变化
• 2.4.4 突变位点的分析
• 2.5 小结
• 2.6 参考文献
• 第三章 突变体酶的表达和分离纯化
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 主要仪器
• 3.2.2 主要试剂
• 3.2.3 实验菌株
• 3.2.4 培养基
• 3.2.5 溶液配制
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 酯酶活力测定
• 3.3.2 蛋白浓度的测定
• 3.3.3 蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 3.4 突变体的表达和分离纯化
• 3.4.1 热变性
• 3.4.2 Ni-NTA 琼脂糖凝胶亲和柱层析
• 3.5 结果与讨论
• 3.5.1 分离纯化中酶的收率和纯度分析
• 3.5.2 突变体酶表达量提高
• 3.6 小结
• 3.7 参考文献
• 第四章 突变体的基本酶学性质
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料
• 4.2.1 实验仪器
• 4.2.2 实验试剂
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 酯酶活力的测定
• 4.3.2 温度对酶活力的影响
• 4.3.3 pH 对酶活力的影响
• 4.3.4 动力学测定
• 4.3.5 不同底物的碳链长度对酶活力的影响
• 4.3.6 金属离子和表面活性剂对酶活的影响
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 对不同链长底物的水解能力的分析
• 4.4.2 温度对催化活性的影响
• 4.4.3 动力学常数和最适温度的测定
• 4.4.4 pH 对酶活的影响
• 4.4.5 金属离子及表面活性剂对酶活力的影响
• 4.5 小结
• 4.6 参考文献
• 第五章突变体稳定性的研究
• 5.1 引言
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 高温条件下酶的热失活曲线的测定
• 5.2.2 酶的热失活参数的确定
• 5.2.3 高温条件下酶的荧光光谱的变化
• 5.2.4 pH 稳定性
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 高温条件下酶的热失活曲线的测定
• 5.3.2 高温条件下酶的荧光光谱的变化
• 5.3.2.1 突变体在 80℃时的荧光光谱
• 5.3.2.2 90℃和 100℃时突变体和野生型的荧光光谱
• 5.3.3 pH 稳定性
• 5.4 小结
• 5.5 参考文献
• 摘要
• Abstract
• 致 谢
• 导师及作者简历